MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Funktionelle und zellbiologische Charakterisierung
von Mutationen im MRP2-Protein, die zum
Dubin-Johnson-Syndrom führen
V. Keitel, A. Nies, M. Brom, J. Hummel-Eisenbeiß,
D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: H. Spring, J. Kartenbeck, Zellbiologie,
DKFZ (Konfokale Laserrastermikroskopie und
Immunelektronenmikroskopie)
Mutationen im MRP2-Gen, die zu einem Ausfall des MRP2-
Proteins in der apikalen Membran der Hepatozyten führen,
sind die molekulare Ursache für das Dubin-Johnson-Syndrom
des Menschen [10,11,17,20]. Das Dubin-Johnson-
Syndrom geht mit einer konjugierten Hyperbilirubinämie
einher, da MRP2 die ATP-abhängige Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate
in der apikalen Membran von Hepatozyten
ist [10,17,20]. In Fortführung unserer Arbeiten (Keitel et
al., Hepatology 32: 1317-1328, 2000) haben wir zwei weitere,
bei Patienten mit Dubin-Johnson-Syndrom relativ häufig
auftretende Nukleotidaustausche (Mor-Cohen et al., J. Biol.
Chem. 276: 36923-36930, 2001), in die MRP2-cDNA eingebracht
und nach Expression der cDNA die Lokalisation
der mutierten MRP2-Proteine in polarisierten HepG2-Zellen
untersucht [11]. Der größte Anteil des MRP2-I1173F-
Proteins akkumulierte als unreifes Protein im endoplasmatischen
Retikulum und wurde im Proteasom abgebaut; ein
geringer Anteil des Proteins gelangte auch zur apikalen
Membran der HepG2-Zellen [11]. MRP2-R1150H hingegen
erreichte die apikale Membran zum gleichen Anteil wie nichtmutiertes
MRP2 [11]. Sowohl MRP2-I1173F (Mor-Cohen
et al. und [11]) als auch MRP2-R1150H (Mor-Cohen et al.)
sind funktionell inaktiv. Unsere Untersuchungen haben zur
Aufklärung von Konsequenzen von MRP2-Mutationen beigetragen.
Diese können zum Verlust eines funktionell aktiven
MRP2-Proteins in der apikalen Membran von
Hepatozyten und damit zum Dubin-Johnson-Syndrom des
Menschen führen.
Funktionelle Rekonstitution von gereinigtem
MRP2
W. Hagmann, J. Schubert, J. König, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer und T. Kempf, Zentrale
Proteinanalytik, DKFZ
Die Reinigung von MRP2 ist eine unabdingbare Voraussetzung
zur genauen Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften
dieses Transporterproteins. Nach erfolgreicher
Klonierung und Reinigung von MRP2 mit Hilfe einer carboxyterminal
eingefügten His 6 -Sequenz konnten wir zeigen, dass
dieses gereinigte Protein nach Rekonstitution in Proteoliposomen
funktionell insoweit intakt war, als es substrat-stimulierbare
ATPase-Aktivität aufwies. Die Rekonstitution von
transport-aktivem MRP2 erforderte darüberhinaus einer
spezifische Auswahl der Solubilisations- und Rekonstitutionsbedingungen.
Unsere Arbeiten zeigten, dass das MRP2-
Protein alleine in der Lage ist, in der geeigneten Lipidvesikelumgebung
als Transporter zu fungieren. Die Transportrate
für LTC 4 in rekonstituierten MRP2-Proteoliposomen betrug
2.7 pmol x min -1 x mg MRP2 -1 [4], die K m -Werte für ATP
und LTC 4 beliefen sich dabei auf 560 µM und 450 nM. Dieser
Transport durch gereinigtes MRP2 war hemmbar durch
den Leukotrien-Rezeptorantagonisten MK571 mit einer
50%igen Hemmung bei etwa 12 µM. Bindungs- und
Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass MRP2 mit dem
Chaperon Calnexin assoziieren kann. Allerdings konnten wir
Abteilung A090
Tumorbiochemie
in Rekonstitutionsversuchen mit gereinigtem Calnexin und
MRP2 keinen Einfluss dieses Chaperons auf die Transportfunktion
von MRP2 feststellen [4]. Interessanterweise sind
sowohl MRP2 als auch das ERM-Protein Radixin in sogenannten
Lipid raft-Membranfraktionen aus humanen Lebern
und Hepatomazellen enthalten. Allerdings konnten
wir trotz der in der Immunfluoreszenz beobachteten
Kolokalisation von MRP2 und Radixin an der kanalikulären
Hepatozytenmembran aus Immunpräzipitationsstudien keine
Hinweise für eine direkte oder indirekte Interaktion dieser
beiden Proteine in menschlichen Zellen finden.
Ko-Transport von reduziertem Glutathion mit
Gallensalzen durch den ABC-Transporter MRP4
(ABCC4)
M. Rius, A.T. Nies, J. Hummel-Eisenbeiß,
G. Jedlitschky, D. Keppler
Hepatozyten und Astrozyten sind wichtige Quellen für reduziertes
Glutathion (GSH) im Organismus. Die molekulare
Identität des Transportproteins, welches GSH freisetzt, war
bisher unbekannt. Die Klonierung von menschlichem MRP4
(ABCC4) und seine stabile Expression in V79-Fibroblasten,
hat funktionelle Studien zur Substratspezifität von MRP4
ermöglicht [14]. Unsere Untersuchungen zeigten erstmals,
dass MRP4 den ATP-abhängigen Ko-Transport von GSH oder
S-Methylglutathion zusammen mit mono-anionischen Gallensalzen
(Cholyltaurin, Cholylglycin, Cholat u. a.) ermöglicht.
Der K -Wert für reduziertes Glutathion lag bei 2,7 mM,
m
was im Bereich der intrazellulären GSH-Konzentrationen liegt.
Der K -Wert für Cholyltaurin lag bei 3,8 µM. Der Transport
m
von Gallensalzen war in Abwesenheit von GSH oder ATP
vernachlässigbar. Die Herstellung von MRP4-spezifischen Antikörpern
hat dessen Lokalisation in der basolateralen
Membran von Hepatozyten des Menschen, der Ratte und
der Maus ermöglicht. Darüber hinaus wurde MRP4 in der
Plasmamembran von Hepatomzellen (HepG2) und
Astrozyten nachgewiesen [14].
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] Nies, A.T.; Spring, H.; *Thon, W.F.; Keppler, D.; Jedlitschky,
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[2] Jedlitschky, G; Keppler, D.: Transport of leukotriene C and 4
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DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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