MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
Studien, die im besonderen Genom- und Expressionsprofilstudien
ergänzten, eingesetzt [20, 39-41].
Funktionelle Architektur des Interphase-Zellkerns
Interphase-Chromosomen sind territorial organisiert, wobei
Gene vor allem in der Peripherie dieser Territorien liegen
(Kurz et al. 1996) während die sog. nuclear bodies
typischerweise außerhalb von Chromosomen-Territorien
gefunden werden. Das sogenannte ICD-Modell (ICD: Interchromosomal
Domain) postuliert darüber hinaus, dass zwischen
den Chromosomen-Territorien ein funktionelles nukleares
Kompartiment existiert, welches mit der Transkription
zusammenhängt (Zirbel et al. 1993).
Zur Charakterisierung der strukturellen und funktionellen
Organisation des Interphase-Zellkerns (siehe auch [8])
untersuchen wir in diesem Zusammenhang die Lokalization
genomischer Sequenzen relativ zur Ausdehnung des zugehörigen
Chromosoms durch Fluorescence in-situ
hybridiszation (FISH), die Verteilung und Dynamik endogener
wie exogener Substanzen bzw. Partikel durch 3-dimensionale,
zeitaufgelöste Laser-Scanning Mikroskopie, sowie
die Diffusionswege exportkompetenter RNA.
Neuere FISH-Untersuchungen mit Proben zu transkriptionell
aktiven Regionen im Vergleich zu Regionen ohne bekannte
Funktionalität zeigen, dass die inaktiven Regionen hauptsächlich
an der Kernperipherie lokalisiert sind, während transkriptions-aktive
Regionen eher zum Innern des Zellkerns
hin lokalisiert sind. Mit der Vorstellung, dass das Chromatin
durch seine Struktur diffusionsabhängige Prozesse hemmt,
wäre es also denkbar, dass Chromosomenterritorien kernperipher
dichter gepackt sind als im Kerninnern. Bezogen auf
den ICD wäre dann zu erwarten, dass der interchromosomale
Raum nahe der Kernperipherie enger und schärfer
begrenzt ist, der ICD sich in Richtung Zentrum des Kerns
dagegen lakunenartig aufweitet und sich der Übergang zu
den angrenzenden Chromosomenterritorien zunehmend
verwischt. Zur Darstellung dieses funktionell aktiven, diffusionskompetenten
Raumes arbeiten wir aktuell an einer
Methode, selektiv die exportaktive, endogene RNA zu
markieren.
Mikroinjizierte Dextrane verteilen sich sehr schnell im Zellkern.
Injektion fluoreszenzmarkierter Dextrane unterschiedlicher
molekularer Grösse hat gezeigt, dass die Verteilung
mit zunehmender Größe inhomogener wird [44]. Für größere,
partikuläre Molekülaggregate, z.B. die endogenen
nuclear bodies, war schon in der Vergangenheit gezeigt
worden, dass sie nicht in Chromosomenterritorien eingebettet
liegen (Zirbel et al. 1993). Im Besonderen gilt das
auch für exogen exprimiertes Xenopus vimentin (in collaboration
with H. Herrmann, DKFZ). Vimentin gehört zu
den zytoplasmatischen Intermediärfilamenten. Die Variante
aus dem Krallenfrosch lässt sich temperaturabhängig
reversibel polymerisieren: Temperaturen unter 30°C induzieren
die Bildung von Vimentinbündeln im Kern von Zellen,
die mit NLS-Vimentin transfiziert wurden. Diese Bündel
folgen den Oberflächen von Chromosomenterritorien,
sie dringen nicht in die Territorien ein Kolokalisation mit
Markern für nuclear bodies wir z.B. speckles, PML-bodies
oder Cajal bodies zeigen diese bodies häufig in unmittelbarer
Nähe zu den Vimentin-Bündeln. Diese räumliche Nähe
ist nicht durch eine Affinität der Vimentin-Filamente mit
den Proteinbodies erklärbar, da einerseits Lebendbeobachtungen
zeigen, dass sich beide Komponenten über
die Zeit voneinander trennen können, anderseits zeigen
elektronenmikroskopische Untersuchungen, dass sich die
Abteilung B060
Molekulare Genetik
Komponenten nicht miteinander verbinden. Vielmehr erklärt
sich die räumliche Nähe besser durch die Begrenzung
des zur Verfügung stehenden Raumes: Die partikulären
Kernbestandteile, die nicht in die Chromosomenterritorien
vordringen können, müssen sich zwischen den Territorien
aufhalten und werden dort zusammengedrängt. Ihre Mobilität
ist dann mitbestimmt durch die Dynamik der Formveränderungen
der Territorien. Messungen zur Dynamik von
PML-bodies, Cajal-bodies und ektopisch exprimierten, kleinen
Protein-Kristallen (YFP-Mx1) legen nahe, dass die Beweglichkeit
dieser Partikel durch zwei Diffusionskonstanten bestimmt
ist, die sich in einem Modell für ‘coralled diffusion’
als Zusammenspiel von der Eigendiffusion des Partikels im
Nucleoplasma und der ‘Diffusion’ des zeitlich veränderlichen
Raumes zwischen den Chromosomenterritorien verstehen
lassen.
Publikationen (* = externer Koautor)
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DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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