MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Vergleich zur Plazebogruppe erhöhte Rate an Regressionen,
allerdings wieder ohne eindeutiges immunologisches
Korrelat bei den betreffenden Frauen. Weiterführende klinische
Untersuchungen mit HPV 16 L1/E7 CVLPs werden
nach einer strategischen Entscheidung von der MediGene
AG nicht durchgeführt, eine Kooperation mit anderen Firmen
ist wegen der komplizierten Patentsituation nicht zu
erwarten.
Wir haben deshalb unsere Aktivitäten auf die folgenden
Bereiche verlegt:
1) Entwicklung von HPV 16 E7-spezifischen DNA
Vakzinen zur adjuvanten Behandlung von
Zervixkarzinom-Patientinnen
Untersuchungen zur Steigerung der Immunantwort bei DNA
Immunisierung haben ergeben, dass die Expressionsstärke
von unterschiedlich modifizierten HPV 16 E7 Expressionsplasmiden
(verschiedene Vektoren, Veränderung der Kodons,
Verknüpfung mit Kozak Sequenzen) nach Transfektion
in Zellen in Kultur direkt mit der Höhe der T-Zellantwort
in C57B/6 Mäusen korreliert [18]. Da HPV VLPs mit hoher
Effizienz auch in Dendritische Zellen (DCs) aufgenommen
werden und diese dabei aktivieren, haben wir untersucht,
ob durch Assoziation von Expressionsplasmiden mit VLPs
(Verpackung als Pseudovirionen oder chemische Kopplung)
die Immunogenität des von dem Plasmid kodierten Antigens
gesteigert werden kann. Anders als bei der Verknüpfung
von HPV 16 E7 Expressionsplasmiden mit dem HSV
VP22 Gen [8,9] konnte bei diesen Experimenten (auch
nach Kopplung an ein zellbindendes Peptid des Strukturproteins
L2) kein Effekt auf die Plasmid-vermittelte Immunantwort
gemessen werden [5]. Gegenwärtig untersuchen
wir die Möglichkeit der Kopplung von E7 an Fc-Sequenzen,
in der Annahme, dass aufgrund des Vorliegens von entsprechenden
Rezeptoren auf DCs dort eine zielgerichtete
Einschleusung erreicht werden kann.
Da selbst bei Tumorpatienten eine Immunisierung mit der
DNA eines Onkogens ethisch nicht zu rechtfertigen ist,
verfolgen wir das von uns entwickelte Konzept der
rearrangierten (shuffled) E7 Gene (E7SH). Dabei werden
einzelne, etwa 100 NT lange Segmente des für 97 Aminosäuren
kodierenden Gens umgeordnet und zusätzlich die
Sequenzen an den Übergängen zweier ursprünglich benachbarter
Segmente angehängt, um keines der theoretisch
möglichen T Zellepitope zu verlieren (Osen et al.,
Vaccine 19:4276, 2001). Bei den neu hergestellten E7SH
Genen wurden gezielt diejenigen Bereiche voneinander
getrennt, die für die E7-abhängige Transformation von
Zellen notwendig sind (Rb-Bindungsstelle und S-S-Brücken).
Außerdem wurden die Kodons in einzelnen Bereichen verändert,
um die Wahrscheinlichkeit der Rekombination zum
E7 Wildtyp zu verringern. Diese so modifizierten Gene haben
die Fähigkeit zur Transformation von Mausfibroblasten
verloren. Vor der Anwendung am Menschen müssen noch
entsprechende Experimente an menschlichen Zellen durchgeführt
werden. Immunisierung von C57B/6 Mäusen mit
verschiedenen E7SH Genen in dem für die Verwendung
am Menschen zugelassenen Expressionsvektor pTH führten
zur Induktion von E7-spezifischen T-Zell Antworten
und zur Regression von HPV-positiven syngenen Tumoren
[12]. Nach Abschluss der präklinischen Untersuchungen,
Sicherung der Finanzierung und Genehmigung durch die
Kommission Somatische Gentherapie der Bundesärztekammer
soll an der Universitäts-Frauenklinik Jena eine
klinische Studie zur adjuvanten Therapie von Zervixkarzi-
Abteilung F020
Genom-Veränderungen und Carcinogenese
nompatientinnen durchgeführt werden. Ein positives Votum
der Ethikkommission dafür liegt bereits vor.
2) Entwicklung von HPV 16 chimären Kapsomeren
Kapsomere sind die pentameren Untereinheiten der HPV
Kapside, die durch Expression des N-terminal um 10 Aminosäuren
verkürzten L1 als GST-Fusionsprotein in E. coli
und nach Abspaltung des GST hergestellt werden können.
Im Vergleich zu VLPs sind die Kapsomere stabil auch
nach Präzipitation und Lagerung bei Zimmertemperatur.
Durch die Etablierung eines Systems zum Nachweis der
L1-spezifischen T-Zellantwort in C57B/6 Mäusen (Identifizierung
eines Db-restringierten CTL Epitops) konnten wir
zeigen, dass die Immunisierung mit Kapsomeren ähnlich
effizient wie mit VLPs nicht nur - wie bereits bekannt -
neutralisierende Antikörper induziert sondern auch zu einer
CTL-abhängigen Regression von HPV 16 L1 exprimierenden
syngenen Tumoren führt. Die Immunisierungsexperimente
zeigten auch, dass die intranasale Applikation
fast ebenso wirkungsvoll ist wie die standardmäßig
durchgeführte subkutane Verimpfung der Kasomere [11]
und durch Verwendung einer modifizierten Untereinheit
A1 des Cholera Toxins (CTA1) als Adjuvans in ihrer Effizienz
noch verstärkt werden kann. Die Modifikation von CTA
besteht in dessen Kopplung an die dimerisierte Immunglobulin-Bindungsdomäne
D aus S. aureus, wodurch dieses
Protein (CTA1-DD) mit hoher Spezifität an Antigenpräsentierende
B Zellen (und nicht mehr an die empfindlichen
Zellen der Darmschleimhaut) bindet und dadurch seine
toxischen Eigenschaften verliert. Da sich somit auch die
Möglichkeit für einen Einsatz auch am Menschen ergibt
untersuchen wir zusätzlich die Anwendung von CTA1-DD
als Adjuvans bei transkutaner Immunisierung mit isolierten
Proteinen oder HPV Partikeln. Nach der Etablierung der
optimalen Bedingungen für die Vorbehandlung der Maushaut
wurden in den ersten Experimenten viel versprechende
Ergebnisse erhalten.
Aufgrund der positiven Befunden mit HPV 16 L1 Pentameren
wurden chimäre Kapsomere hergestellt, die aus 5
Molekülen von L1 und E7 bestehen. Erste Experimente
Vollänge
zeigen sowohl eine L1- wie eine E7-spezifische T-Zell Antwort
[11]. Damit sind chimäre Kasomere gut geeignete
Kandidaten zum Einsatz in Ländern der Dritten Welt (geringe
Produktionskosten in E. coli, ungekühlte Lagerung)
und bieten außerdem die Möglichkeit zur Insertion längerer
heterologer Sequenzen (E7, E6). Sie erfüllen auch die
von der WHO für den Einsatz in diesen Ländern geforderten
Eigenschaften einer kombinierten (prophylaktischen
und therapeutischen) Vakzine. In Zusammenarbeit mit Drs.
R. Garcea, Denver und L. Villa, Sao Paulo planen wir die
Entwicklung dieser chimären Kapsomere zur Verhinderung
und Behandlung persistierender HPV 16 Infektionen (Post-
Expositionsprophylaxe). Falls eine Finanzierung von nichtkommerzieller
Seite erhalten werden kann sollen klinische
Studien in Brasilien durchgeführt werden.
Untersuchungen zur Immunogenität von CVLPs
Zur Untersuchung der Immunogenität von CVLPs etablierten
wir das System der in vitro Beladung von dendritischen
Zellen (DC) aus Knochenmark von C57B/6 Mäusen. Die
Immunogenität der Partikel wurde durch Aktivierung existierender
L1- oder E7-spezifischer T Zell Klone oder durch
die de novo Induktion von T-Zellen in vitro oder nach Reinokulation
der beladenen DCs gemessen. Dabei konnten
wir zeigen, dass L1-spezifische Antikörper die Effizienz der
Immunantwort entscheidend beeinflussen, die - je nach
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
387