MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
diesen Kernstrukturen liegt auch darin begründet, dass ihre
Anzahl, Struktur und Zusammensetzung offensichtlich mit
Veränderungen in der Genexpression, dem Differenzierungsgrad
einer Zelle sowie pathologischen Veränderungen einhergeht.
Die morphologisch auffälligste intranukleäre Substruktur ist
der Nukleolus. Diese charakteristische Kernstruktur ist ein
Beispiel für eine multifunktionelle Kerndomäne. Neben seiner
bekannten Grundfunktion in der Ribosomenbiosynthese
konnten dem Nukleolus in jüngster Zeit zusätzliche Funktionen
sowohl bei der Zellzyklus-Kontrolle, dem Kernexport
von Proteinen, bei Alterungsprozessen als auch bei der
Bildung oder dem Transport verschiedenster Ribonukleoproteinpartikel
nachgewiesen werden. Der Nukleolus ist
seit Jahrzehnten der prominenteste Zellkernmarker für die
Krebsdiagnose. Sowohl die Nukleolusstruktur als auch die
dort stattfindenen Prozesse unterliegen signifikanten Veränderungen
in malignen Zellen. Daher sind detaillierte
Kenntnisse der Funktion und Struktur des Nukleolus, seiner
molekularen Zusammensetzung sowie der Regulationsmechanismen
der Ribosomenbiogenese von großer Bedeutung
auch für das Verständnis der molekularen Ereignisse,
die während der Entstehung von Tumorzellen stattfinden.
Aufbauend auf früheren und aktuellen Ergebnissen ist eines
der Hauptziele dieser Arbeitsgruppe, neue nichtribosomale
Proteine des Nukleolus zu identifizieren, biochemisch
und molekularbiologisch zu charakterisieren und in
ihrer strukturellen Anordnung innerhalb des Nukleolus aufzuklären.
Als biologisches Ausgangsmaterial dienen dafür
häufig die Oocytenkerne des Krallenfrosches Xenopus laevis.
Diese enthalten eine hohe Anzahl extrachromosomaler,
amplifizierter Nukleolen (ca. 1000/Kern) und sind somit
prädestiniert für die Untersuchung topologischer Prinzipien
der Ribosomen-Biosynthese sowie der strukturellen
Organisation dieser intranukleären Hauptkomponente.
Ein spezieller Schwerpunkt unserer Arbeiten ist die Identifizierung
bzw. Charakterisierung von Strukturproteinen
(Karyoskelett-Proteine) des Zellkerns. Von besonderer
Bedeutung war daher die kürzlich gelungene Identifizierung,
Klonierung und Sequenzierung eines neuartigen,
nukleolären Proteins NO145 aus Oocytenkernen, das sich
in seinen Eigenschaften und insbesondere in seiner Topologie
von allen bisher bekannten Nukleolusproteinen unterscheidet.
Die biochemischen Eigenschaften von NO145
(resistent gegen Extraktionen mit Puffern hoher Ionenstärke
und Detergenz) lassen den Schluss zu, dass es sich
Abb. 1: (A): Differenzielle Interferenzkontrast-Aufnahme (DIC)
eines Nukleolus einer Kerninhaltsspreitung von Xenopus laevis
Oocyten.
(B): Entsprechende konfokale Laserscan Aufnahme einer
Doppelimmunfluoreszenz von Protein NO145 (grün) und Protein
xNopp180 (rot).
Eichstrich: 5 µm (aus: Kneissel et al. 2001 Mol Biol Cell 12: 3904-18)
Abteilung A010
Zellbiologie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
hierbei um ein Nukleolus-spezifisches „Karyoskelett-Protein“
handelt. Die Analyse seiner Primärsequenz zeigte, dass
es sich um ein neuartiges Protein handelt, das interessanterweise
in einem kurzen N-terminalen Abschnitt auffällig
hohe Sequenzhomologie zum Protein SCP2 der Ratte, einem
strukturbildenden Protein des meiotischen Synaptonemalkomplexes,
aufweist. Letzteres deutet auf eine funktionelle
Verwandtschaft dieser beiden strukturbeteiligten
Kernproteine hin. Die Gewinnung NO145-spezifischer Antikörper
ermöglichte eine detaillierte Untersuchung dieser
neuen Nukleoluskomponente. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer
Immunlokalisierungsstudien konnte gezeigt
werden, dass NO145 spezifisch in einem filamentösen Netzwerk
im Cortex der amplifizierten Nukleolen vorliegt, wobei
seine Anordnung von der Konzentration bivalenter Ionen
abhängig ist.
Protein NO145 ist in allen Stadien der Oogenese vorhanden.
Kommt es allerdings zur Eireifung und damit zur Auflösung
der Kernhülle und der Nukleolen, ist es nicht mehr
nachweisbar. „Northern-Blot“-Analysen haben allerdings
gezeigt, dass das Verschwinden von NO145 nicht auf der
RNA-Ebene reguliert wird. Zur Zeit wird der für die spezifische
Degradation von NO145 verantwortliche Mechanismus
auf molekularer Ebene analysiert. Da Protein NO145
bisher nur in den Nukleolen der Xenopus-Oocyte nachgewiesen
werden konnte, sollen künftige Untersuchungen
zeigen, ob eine ähnliche nukleoläre Gerüststruktur in anderen
Zelltypen und Spezies durch ein homologes oder
analoges Protein gebildet wird. Als Arbeitshypothese zur
Funktion dieses Proteins wird eine tragende Rolle als topogenes
Karyoskelett-Element vorgeschlagen: Protein NO145
bildet unter physiologischen Bedingungen ein filamentöses
Netzwerk, das den nukleolären Cortex bestimmt, der nukleoläre
Strukturen zu einem spezifischen Reaktionsraum
(Subkompartiment) umschließt und so Größe und Aussehen
der amplifizierten Oocyten-Nukleolen beeinflußt
(Kneissel, 2001, Doktorarbeit an der Fakultät für Biologie,
Universität Heidelberg; Kneissel et al., 2001, Mol. Biol. Cell
12, 3904-3918) (Abb 1).
Es wurde auch damit begonnen, die nukleären bzw. nukleolären
Bindungspartner gut charakterisierter, in ihrer Primärsequenz
bekannter und während der Evolution hochkonservierter
Nukleolusproteine (NO38, NO29, NOH61,
xNopp180 etc.) sowohl auf Nukleinsäure- als auch auf Proteinebene
zu identifizieren, um Aufschluss über mögliche
Wechselwirkungen und biologische Funktionen dieser Proteine
zu erhalten und die Charakterisierung topogener Komplexe
des Nukleolus zu ermöglichen. Darüber hinaus wird
die architektonische und/oder funktionelle Bedeutung dieser
Proteine mittels RNA-Interferenz-Technik untersucht.
Kürzlich gelang die Identifizierung und molekulare Charakterisierung
eines neuartigen, evolutionär hoch konservierten
Nukleolusproteins (Protein NO66). Dieses zeigt ein interessantes
intrazelluläres Verteilungsmuster: neben einer signifikanten
Anreicherung in den Nukleolen akkumuliert es
in den meisten Zelltypen zusätzlich in distinkten nukleoplasmatischen
Substrukturen. Ko-Lokalisierungsstudien mit
den Proteinen Ki-67, HP1α und PCNA zeigten, dass Protein
NO66 innerhalb des Kernplasmas mit bestimmten Bereichen
spät replizierendem Chromatin assoziiert ist. Während
biochemische Analysen daraufhinweisen, dass Protein NO66
im Komplex mit Vorläufermolekülen der großen Ribosomenuntereinheit
vorliegt, ist seine Funktion bei der Bildung/
Aufrechterhaltung heterochromatischer Bereiche noch
unklar. Offensichtlich übt dieses Protein neben einer wich-