MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt D
Tumorimmunologie
Ib. Funktion von C4.4A, D5.7A (EpCAM) und
D6.1A (CO 029)
C. Claas, F. Fries, M. Ladwein, C. Paret, J. Wahl,
M. Zöller
In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik,
DKFZ, Prof. Dr. M. von Knebel Doeberitz, Abteilung molekulare
Pathologie, Universität Heidelberg, Prof. Dr. K. Z’graggen und PD
Dr. J. Weitz, Chirurgische Universitätsklinik, Heidelberg, Prof. Dr.
W. Tilgen. Dermatologische Klinik der Universität des Saarland,
Prof. U. Weidle, Roche Diagnostics, Penzberg, Prof. Dr. K. Dano
und Prof. Dr. M. Ploug, Finsen Laboratorien, Kopenhagen, Dänemark
Zusatzfinanzierung: DFG, Deutsche Krebshilfe, Roche Diagnostics,
TZHM
C4.4A: C4.4A ist ein GPI-verankertes Membranmolekül mit
Ähnlichkeit zum Urokinaserezeptor (uPAR). Über die Bindung
und Aktivierung von uPA trägt dieser Rezpetor wesentlich
zur Degradation von Elementen der extrazellulären
Matrix bei. Neuere Befunde belegen, dass uPAR darüber
hinaus auch in proteolyse-unabhängige Signaltransduktion
involviert ist, wozu seine Assoziation mit Integrinen wesentlich
beiträgt. Sowohl in der Ratte als auch beim Menschen
wird C4.4A nur in sehr geringem Umfang auf gesundem
Gewebe, vornehmlich auf Epithelien der Basalschicht
der Epidermis und sehr schwach auf Subpopulationen von
Makrophagen, exprimiert. Hingegen wird C4.4A auf Karzinomen
häufig exprimiert und es gibt Hinweise, dass die Expression
mit der Metastasierungstendenz korreliert. Die im
Vergleich zu uPAR sehr restringierte Expression auf Normalgewebe
und die vergleichbar hohe Expression auf Tumoren
lässt C4.4A als therapeutisches Kandidatenmolekül sehr
geeignet erscheinen, sofern C4.4A uPAR-ähnliche Funktionen
erfüllt. Um die physiologische Funktion des Moleküls
zu evaluieren, haben wir die Generierung von C4.4A ko
Mäusen in Angriff genommen. Zur Identifikation von potentiellen
Liganden wurde rekombinantes, lösliches C4.4A
erstellt. Erste Ergebnisse zeigen, dass C4.4A selektiv an
Laminin 1 und Laminin 5 bindet (Paret et al, in Vorb.).
Daneben erkennt es einen noch nicht-identifizierten Serumfaktor,
der auch an uPAR bindet. Untersuchungen zu Promotor-
und Enhancersequenzen von C4.4A sind weitgehend
abgeschlossen. Diese Studien sind besonders im Hinblick
auf die Hochregulation der Expression von C4.4A auf
metastasierenden Tumorzellen wesentlich. Die bisher erzielten
Ergebnisse bestätigen die Induzierbarkeit der Expression
durch einen Serumfaktor, der noch definiert werden
muss (Fries et al., in Vorb.).
D5.7A / EpCAM: Wenngleich EpCAM bereits in den 80iger
Jahren beschrieben wurde, ist die Funktion des Moleküls
bisher weitgehend ungeklärt. Unser Interesse basiert vor
allem auf der Beobachtung, dass EpCAM / D5.7A mit weiteren
Metastasierung-assoziierten Molekülen, D6.1A und
varianten CD44 Isoformen, assoziiert (siehe Ic) [12]. Um
diese Assoziation genauer zu definieren, wurden Deletionsmutanten
der einzelnen Domänen des Moleküls erstellt,
deren funktionelle Charakterisierung zur Zeit erfolgt.
D6.1A / CO-029: Neben varianten CD44 Isoformen ist
für den Metastasierungsprozess mit hoher Wahrscheinlichkeit
vor allem das Tetraspanin D6.1A von essentieller Bedeutung.
Tetraspanine sind wichtig für Adhäsion, Migration,
Proliferation, Aktivierung, Differenzierung und Metastasierung.
Man geht davon aus, dass diese vielfältigen Funktionen
auf der Fähigkeit der Tetraspanine beruht, Molekül-
Cluster zu bilden, die neben weiteren Tetraspaninen vor
allem Integrine einschließen. Für D6.1A konnten wir bisher
Abteilung D060
Tumorprogression und Tumorabwehr
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
neben einer Assoziation mit dem Tetraspanin CD9, eine
Assoziation mit α6β1, α3, und möglicherweise mit α6β4
Integrinen, sowie eine schwache Assoziation mit D5.7A
und CD44 beobachten. Darüber hinaus konnte in Kooperation
mit der zentralen Einheit für Proteinanalytik eine Assoziation
mit FPRP nachgewiesen werden. Letztere erscheint
von besonderem Interesse, da FPRP auch in direkter Assoziation
mit CD9 gefunden wird und innerhalb der Familie
der Tetraspanine D6.1A und CD9 sich besonders ähnlich
sind. Dennoch zeichnen sich Unterschiede zwischen D6.1A
und CD9 ab. Wie erwähnt, nehmen Tetraspanine Einfluss
auf die Zellmigration. Dies geschieht u.a. durch die Internalisierung
von Integrin-Tetraspanin-Komplexen und der Re-
Expression des Integrins (oder des Komplexes) an der migratorischen
Front der Zelle. Wir haben Hinweise, dass vornehmlich
D6.1A an der Internalisierung und dem Transport
in endosomalen Vesikeln von Integrinen beteiligt ist
(Wahl et al., in Vorb.). Von besonderem Interesse für die
Funktion von Tetraspaninkomplexen ist auch ihre Lokalisation
in bestimmten Membransubdomänen, den sog.
“Lubrol rafts”. Die Phosphatidyl-Inositol-4-Kinase ist eine
Komponente von Tetraspaninkomplexen. Wenngleich
Tetraspaninkomplexe auch ausserhalb von “Lubrol rafts”
gefunden werden, wird die enzymatische Aktivität
Tetraspaninkomplex-assoziierter Phosphatidyl-Inositol-4-
Kinase (PI4K) essentiell vom Membranmikroenvironment bestimmt
[13]. Die funktionelle Bedeutung der Assoziation
speziell von D6.1A mit der PI4K erfordert weitere Untersuchungen.
Ic. Konnektivität und konzertierte Aktivität
Metastasierung-assoziierter Moleküle
C. Claas, S. Gesierich, P. Klingbeil, M. Zöller
Zusatzfinanzierung: DFG, Deutsche Krebshilfe, TZHM
Die Überexpression der 5 beschriebenen Metastasierungassoziierten
Moleküle wurde auf einer Reihe metastasierender
Tumoren unterschiedlichen Ursprungs beobachtet.
Es gibt zumindest zwei Möglichkeiten diese konzertierte
Expression zu erklären: i. Die Expression dieser Moleküle
wird über ein Gen reguliert; ii. Die Ko-Expression dieser
Moleküle ist erforderlich, damit eine Tumorzelle alle Schritte
der Metastasierungskaskade durchlaufen kann. Unabhängig
davon, ob die konzertierte Expression dieser Moleküle
auf die Aktivierung eines „Master-Gens“ zurückzuführen
ist oder auf einem Selektionsprozess beruht, besteht
die Möglichkeit einer wechselseitigen Einflussnahme der
funktionellen Aktivitäten dieser 5 Moleküle in dem Sinne,
dass die Funktion der einzelnen Moleküle durch die Assoziation
mit den weiteren Molekülen verändert wird. Wir
haben eine Reihe von Evidenzen, die diese Arbeitshypothese
unterstützen.
i. Einige dieser Moleküle können miteinander interagieren:
Das Tetraspanin D6.1A assoziiert mit dem Tetraspanin CD9,
den Integrinen α6β1 und α3β1, mit D5.7A (EpCAM) und
weiteren Membranmolekülen; C4.4A kann mit Integrinen
assoziieren; die CD44v4-v7 Isoform, nicht aber die CD44
Standardisoform, assoziiert mit den Tetraspaninen CD9 und
D6.1A sowie mit D5.7A [14];
ii. In Abhängigkeit davon, ob diese Moleküle isoliert oder
als Komplex vorliegen, erfüllen sie unterschiedliche Funktionen:
Im Kontext mit weiteren Metastasierung-assoziierten
Molekülen unterstützt C4.4A den Abbau extrazellulärer
Matrix, Überexpression von C4.4A bewirkt dies nicht; Die
Induktion einer Verbrauchskoagulopathie durch D6.1A ist