MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Zellzykluskontrolle und Carcinogenese (F045)
Leiterin: PD Dr. rer. nat. Ingrid Hoffmann
Doktoranden
Ingo Hassepass (-5/03) Melanie Volkening
Silke Warnke Alexander Mion
Daniel Spengler
Diplomanden
Stefan Kemmler (6/02-2/03) Onur Cizmecioglu (10/03-)
Technisches Personal
Renate Öttl (3/02-11/03)
Die Rolle von Cdc25 Phosphatasen im Zellzyklus
I. Hoffmann, I Hassepass
In Zusammenarbeit mit R. Voit, DKFZ
Viele wichtige Übergänge im Zellzyklus werden durch Kontrollpunkte
(checkpoints) reguliert. Hierzu gehören das Einleiten
der DNA-Replikation am G1/S-Kontrollpunkt sowie
der Übergang in die Mitose. Kontrollpunkte können durch
das Auftreten von DNA-Schäden aktiviert werden. Diese
Aktivierung führt nach Hemmung der Zellzyklus-Progression
entweder zur Transkription von Genen, die an der DNA-
Reparatur beteiligt sind oder, falls die DNA-Schäden irreparabel
sind, zur Induktion der Apoptose.
Die Phosphataseaktivität von Cdc25A ist essentiell für den
Eintritt in die S-Phase und zwar durch die Dephosphorylierung
der Kinasen Cdk2/CyclinE und auch Cdk2/CyclinA.
Eine Hemmung der Cdc25A Funktion durch Mikroinjektion
mit spezifischen Antikörpern gegen die Phosphatase in Zellen
der G1-Phase verhindert den Übergang in die S-Phase. Des
Weiteren führt eine Überexpression von Cdc25A in einem
induzierbaren System zu einer verfrühten Aktivierung von
CyclinE und CyclinA assoziiertem Cdk2.
In unserer Arbeitsgruppe wurde die Beteiligung der
Cdc25A-Phosphatase an der Kontrollpunktantwort nach
UV-vermittelten DNA-Schäden untersucht [1]. Werden
DNA-Schäden durch UV-Bestrahlung induziert, wird die Chk1
Kinase von der ATR-Kinase durch Phosphorylierung aktiviert.
Nach erfolgter UV-Bestrahlung von Zellen wird
Cdc25A rasch degradiert. Bedingt durch die Cdc25A-
Degradation nahm die Phosphataseaktivität deutlich ab [2]
welches zum Verlust der Cdk2/CyclinE-Aktivierung führt und
damit den Zellzyklus in der G1-Phase arretiert. Durch die
Methode der 2D-Phosphopeptidkartierung wurden die
Serine an Positionen 75, 123 und 177 im Cdc25A Protein
als Phosphorylierungsstellen der Chk1 Kinase identifiziert.
In vivo wurde ebenfalls eine Phosphorylierung an Serin75
nachgewiesen. Die Substitution des Serin75 durch Alanin
führte zu einer Stabilisierung nach UV-vermittelten DNA-
Schäden, während das Wildtyp-Protein sowie die Serin123A
bzw. Serin177A-Mutanten schnell degradiert wurden. Darüber
hinaus konnte dargestellt werden, dass die kurze
Halblebenszeit von Cdc25A eine Phosphorylierung an
Serin75 erfordert. Die Cdc25A-S75A-Mutante bleibt in unbehandelten
Zellen stabil, dagegen besitzen Cdc25A wt
und die Cdc25A-S123A Mutante eine Halblebenszeit von
ca. 25 Minuten. Die hohe Stabilität der Cdc25A-S75A Mutante
im Vergleich zum Wildtyp hat nach UV-vermittelter
DNA-Schädigung eine fortgesetzte Aktivierung des Cdk2/
CyclinE-Komplexes zur Folge. Unsere Arbeiten haben gezeigt,
dass eine Phosphorylierung an Serin-75 ein Erkennungssignal
für SCF darstellen könnte [1]. Interessanterweise
spielt diese Phosphorylierung sowohl beim Abbau
F045
Zellzykluskontrolle und Carcinogenese
von Cdc25A in der Interphase des Zellzyklus als auch nach
UV-induzierter DNA-Schädigung eine Rolle.
Funktion humaner Polo-Kinasen im
Centrosomenzyklus
I. Hoffmann, S. Warnke, S. Kemmler,
U. Hoffmann-Rohrer
In Zusammenarbeit mit A. Fry, University of Leicester, England,
UK und B. Lüscher, Universität Aachen
Wichtige Vorgänge im Zellzyklus wie die Übergänge von
der G1- in die S-Phase sowie von der G2- in die M-Phase
werden durch die Familie der cyclinabhängigen Kinasen (Cdk)
kontrolliert. Wie Forschungsarbeiten der letzten Jahre belegen,
sind neben der bereits sehr gut charakterisierten
Cdk Kinasefamilie auch die Polo-Kinasen (Plks) maßgeblich
an der Zellzyklusregulation beteiligt. Benannt nach dem
Polo-Gen von D. melanogaster wurde diese Familie von
Proteinkinasen in vielen Eukaryonten untersucht. In humanen
Zellen exisitieren vier verschiedene Vertreter: Plk 1
- 4. Plk1, die bislang am besten charakterisierte humane
Polo-Kinase spielt eine Rolle bei der Aktivierung der Cdk,
Ausbildung der Mitosespindel sowie bei der Degradation
von Cyclin B am Ende der Mitose. Alle humanen Polo-Kinasen
liegen bei verschiedenen Krebsarten u.a. bei Dickdarmkrebs
in erhöhten Mengen vor.
Die humane Plk2-Kinase wurde in unserer Arbeitsgruppe
isoliert. Es handelt sich um ein 75 kDa Protein, welches in
verschiedenen Brust und Haut-Tumorzellinien überproduziert
vorliegt. Immunpräzipitations-Experimente aus HeLa-Zellextrakten
mit Hilfe spezifischer Plk2 Antikörper zeigen, dass
Plk2-Kinaseaktivität in der Mitte der G1-Phase ihren Höhepunkt
erreicht. In späteren Phasen des Zellzyklus hingegen
wurde keine Kinaseaktivität mehr festgestellt. Mikroinjektionsexperimente
unter Verwendung neutralisierender
Plk2 Antikörper zeigen, dass die Aktivität wichtig ist für
den Eintritt der Zelle in die S-Phase [3]. Diese Ergebnisse
wurden mit Hilfe von RNA-Interferenz (RNAi) Experimenten
bestätigt. Die Lokalisation des Plk2 Wild-Typ-Proteins
sowie der kinase-inaktiven Mutante Plk2-K111R erfolgt am
Centrosom, wie nach transienten Transfektionsexperimenten
in U2OS- und CHO-Zellen festgestellt wurde
[3]. Auch in gereinigten Centrosomenpräparationen ist
eine deutliche Anreicherung von Plk2 zu beobachten.
Weitere Experimente zeigen, dass Plk2 an der Regulation
der Verdopplung der Centrosomen am G1/S-Übergang
beteiligt ist. Diese Resultate deuten darauf hin, dass Plk2
aufgrund seiner dualen Funktion bei der Koordinierung des
Centrosomen- und Chromosomenzyklus eine Schlüsselrolle
spielen könnte.
Publikationen (* = externer Koauthor)
[1] Hassepass, I., Voit, R., and Hoffmann, I. (2003). Phosphorylation
at serine-75 is required for UV-mediated degradation of
human Cdc25A phosphatase at the S-phase checkpoint. J Biol
Chem. 278(32):29824-9
[2] Hassepass, I. und Hoffmann, I. (2004) Assaying Cdc25 phosphatase
activity. In: Checkpoint Controls and Cancer: Methods
and Protocols, J. M. Walker ed. 281, 153-162
[3] Warnke, S., Kemmler, S., *Hames, R.S., *Tsai, H.L.,
Hoffmann-Rohrer, U., Hoffmann, I. (2004). The polo-like kinase
Plk2 is required for centriole duplication in mamalian cells. Curr.
Biol. 14, 1200-1207
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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