MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Applikation von 20-Hydroxyecdyson nicht in der Lage, Histolyse
zu induzieren, segregieren aber trotzdem die in ihnen
gespeicherten glue-granules und weisen das charakteristische
Puffmuster für Chromosomen im Puppenstadium auf.
Diese Befunde zeigen, daß p127l(2)gl für den Zelltod der
Speicheldrüsen erforderlich ist. Um die Funktion von l(2)gl
in diesem Gewebe zu klären, benutzten wir transgene Linien,
die entweder reduzierten (~ 0.1) oder erhöhten
Gehalt an p127l(2)gl (3.0) exprimieren. Diese Studien zeigen,
daß der zeitliche Verlauf der Histolyse der Speicheldrüsen
eine l(2)gl-Dosis-Anwort widerspiegelt. Reduzierte
p127l(2)gl Expression verzögert die Histolyse, während Überexpression
diesen Prozess beschleunigt, ohne dabei die
Dauer des dritten Larvenstadiums sowie der präpupalen
und pupalen Entwicklung zu beeinflussen. Eine ähnliche
l(2)gl-Abhängigkeit fällt beim “timing” der Expression der
Zelltodgene reaper, head involution defective und grim auf.
Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, daß p127 eine
kritische Rolle bei Hervorrufen eines Ecdyson-induzierten
Zelltodes spielt. Unsere Experimente weisen darauf hin,
daß das “timing” des Zelltodes in den Speicheldrüsen manipuliert
werden kann, ohne die Normalentwicklung zu beeinträchtigen
und Wege zu Untersuchungen über die Natur
der Komponenten eröffnet, die an dem Zelltod-“pathway”
in den Speicheldrüsen beteiligt sind.
2.1 Zeitliche Regulation der Histolyse der
Speicheldrüsen von Drosophila durch
Transkriptionsfaktoren des Broad-Complex
Zu den Genen, die bei der Auslösung der Histolyse der
Speicheldrüsen eine wichtige Rolle spielen, gehört reduced
bristles on palpus gene des Broad-Complex (Br-C) Locus.
Um die Rolle des Br-C bei der Auslösung der Speicheldrüsenhistolyse
zu verstehen, unternahmen wir eine Analyse
der verschiedenen Isoformen des Broad-Complex. Der Br-
C Locus kodiert für vier Isoformen von Haupttranskriptionsfaktoren,
BR-C Z1 bis Z4, deren Expression direkt von
Ecdyson über einen Ecdysonrezeptor (EcR/Usp) reguliert
wird. Mit Ausnahme von Mutationen in BR-C Z1, welches
für das Überleben der larvalen Speicheldrüsen in mutierten
Fliegen verantwortlich ist, bringen alle Mutationen, welche
die anderen Br-C-Isoformen betreffen, pupale Letalität
hervor. Experimente mit Transgenen, welche jedes der vier
Haupt-BR-C-Isoformproteine exprimieren zeigten, daß in Abhängigkeit
der Expressionsperiode parallel zu dem
Hauptpeak von Ecdyson BR-C Z1, Z2 und Z4 zunächst den
Prozess der Speicheldrüsenhistolyse inhibierten und danach
stimulierten. BR-C Z3 dagegen übte zu allen Zeitpunkten
eine Hemmung des Speicheldrüsenzerfalls aus [1].
2.2 Zytoskelettproteine regulieren den Chromatin-
Zugang des BR-C Z1 Transcriptionsfaktors und
des SIN3-RPD3 Histon-deacetylase Complexes
beim autophagic Tod der Speicheldrüsen von
Drosophila
Aus früheren Analysen unserer Gruppe wissen wir, daß
p127 l(2)gl physikalisch mit nicht-Muskel-Myosin II schwere
Kette (nmMHC) interagiert. Unsere kürzlich durchgeführten
Studien zeigten, daß p127 l(2)gl und nmMHC die Anlagerung
des BR-C Z1 Transkriptionsfaktors und des SIN3-RPD3deacetylase
Complexes an das Chromatin regulieren. In Speicheldrüsen
von Wildtyp binden diese Faktoren an
Chromatin, jedoch in l(2)gl akkumulieren sie im Zytoplasma
und der ”cortical nuclear zone” (CNZ). Einen ähnlichen Chromatinausschluss
beobachten wir entweder in Speicheldrüsen
von Entwicklungs-verzögerten zip E(br) /+ Larven oder
er wird durch eine hohe nmMHC-Synthese hervorgebracht.
Abteilung A040
Entwicklungsgenetik
Daraus muß man schließen, daß, p127 l(2)gl und nmMHC gemeinschaftlich
die Anlagerung von BR-C Z1 und SIN3-RPD3
an das Chromatin kontrollieren und damit die Kaskade auslösen,
die zur Histolyse der SG führt (Arbeit eingereicht).
3. Voraussetzungen für die
Gonadenentwicklung und die Erhaltung der
Keimbahnzelllinien durch dlg und scrib
B.M. Mechler, M. Li, F. Papagiannouli, J. Marhold,
A Patel, A. Gatos und I. Török
3.1. Das scribble Gen
Das Tumorsuppressorgen scribble (scrib) ist für Epithelpolarität
und Wachstumskontrolle bei Drosophila erforderlich.
Wir isolierten das scribble Gen durch die Identifizierung der
rezessiven Mutation P vartul , welche Letalität im späten Larvenstadium
auslöst und ein komplexes Syndrom, vergleichbar
dem von Mutationen in Tumorsuppressoren, aufweist. Beide
larvalen Gehirnhemisphären und ein Teil der Imaginalscheiben
zeigen massives ”overgrowth” und Verlust der Zellpolarität.
Das scribble kodiert für zwei Proteinisoformen, die durch
alternatives Splicing während der Transkription entstehen
[2]. Beide Scrib-Proteine werden zunächst ubiquitär während
der frühen Embryonalentwicklung exprimiert. Im
weiteren Verlauf der Morphogenese weist jedes der Scrib-
Proteine ein spezifisches Verteilungsmuster im zentralen
und peripheren Nervensystem, CNS und PNS, auf. Während
der Keimstreifextension findet die Expression des größeren
Scrib1 vorzugsweise in den Neuroblasten statt, die
vom Neuroektoderm abstammen. Später beschränkt sich
die Synthese auf Neuronen des CNS sowie auf die Polzellen
der Gonaden. Die kürzere Scrib2-Form wird im PNS
und einem Teil der CNS-Neuronen [2] stark exprimiert. Wir
fanden, daß die Scrib1-Protein-Isoform ganz spezifisch in
neu entstandenen Goaden synthetisiert wird und untersuchten
daher im Detail die Voraussetzungen für seine
Synthese in der Keimbahn und in den somatischen Zellen
der Gonaden. Wir konnten zeigen, daß Scrib1-Synthese in
Polzellen zum Zeitpunkt der Gonadenbildung stark anstieg
und auch in corticalen Domänen der gonadalen Mesodermzellen,
die den Polzellen benachbart sind, vorhanden war.
Die Scrib1-Synthese in den mesodermalen Zellen war unabhängig
von den Polzellen und ließ sich in agametischen
valois und capsuléen Gonaden von Embryonen nachweisen.
Die Scrib1-Synthese in den Polzellen dagegen, erforderte
Kontakt mit gonadalen Mesodermzellen, was wir
durch Fehlen von Scrib1 in wunen oder tinman-zinc finger
homeodomain-1 Pseudogonaden, die nur aus Aggregaten
von Polzellen [3] bestehen, zeigen konnten.
3.2. Das discs large (dlg) Gen
Den Beitrag der Tumorsuppressorgene discs large (dlg),
scribble (scrib) und lethal (2)giant larvae (l(2)gl) zur
Gonadenentwicklung analysierten wir zum Zeitpunkt der
Verschmelzung der gonadalen Mesodermzellen. Die Inkorporation
der Polzellen in die ”gonadal pocket” erfolgt normal
in Embryonen von l(2)gl, scrib und dlg, obwohl eine
signifikante Anzahl von Polzellen außerhalb der scrib und
dlg Gonaden verbleibt. Das Auftreten von nicht-gonadalen
Polzellen könnte eine längere Überlebenszeit der fehlplazierten
scrib und dlg Polzellen in den somatischen Geweben
widerspiegeln. Untersuchungen von larvalen Testes
aus Wildtyp und Mutanten zeigen, daß l(2)gl Testes normale
Größe aufweisen, die Testes von scrib-Larven dagegen
signifikant und Testes von dlg-Larven deutlich kleiner
sind; selbst kleiner als Ovarien des Wildtyps. Da die Anzahl
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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