MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Verwendung von Parvoviren zur Verbesserung des Allgemeinzustandes
bei Tumorpatienten oder Patienten mit chronischen
oder konsumierenden Erkrankungen. Deutsche Patentanmeldung
199 51 795.9; Klein-Bauernschmitt, Eisold, Schlehofer, von
Knebel-Doeberitz, zur Hausen, H.
Use of Parvovirus for Brain Tumor Therapy US-Patentanmeldung
10/426,709 J. Rommelaere, J. Cornelis, C. Dinsart, K. Geletneky,
M. Herrero y Calle, J.R. Schlehofer
C) Adeno-assoziierte Viren: Untersuchungen
zum Infektions-prozess und zur Verwendung
als Gentransduktions-Vektor (F010-3)
J.A. Kleinschmidt, A. Kern, S. Kronenberg, L. Krüger,
D. Kuck, T. Lau, C. Leder, O. Müller, P. Poberschin,
K. Schmidt, D. Waterkamp
In Zusammenarbeit mit: B. Böttcher, EMBL, Heidelberg, M. Hallek,
Genzentrum München, München; M. Müller, DKFZ, A. Salvetti,
Hotel Dieux, Nantes, Frankreich, M. Trepel, Institut für Molekulare
Medizin und Zellforschung, Freiburg; W.J. Zeller, DKFZ, U.
Haberkorn, DKFZ
Gentransfer-Vektoren basierend auf dem adeno-assoziierten
Virus (AAV) zeigen einen breiten Wirtsbereich, infizieren
sowohl proliferierende als auch ruhende Zellen, sind in der
Lage, in das Wirtsgenom zu integrieren, und zeigen nach
heutigem Wissensstand keine pathogenen Eigenschaften.
Der Infektionsprozeß mit Hilfe dieser Vektoren ist noch weitgehend
unverstanden. Insbesondere sind die Strukturen
am Kapsid, welche eine unterschiedliche Suszeptibilität von
primären humanen Zellen für einen AAV vermittelten Gentransfer
vermitteln [1] nicht bekannt. Das Bindungsmotif
am AAV-2 Kapsid mit dem die Viren, bzw. die Vektoren an
den primären Rezeptor der Zielzellen - Heparansulfat Proteoglykan
- binden, konnte identifiziert werden [5]. Dieses
Bindungsmotif konnte nun dahingehend modifiziert werden,
dass AAV-Bibliotheken angelegt wurden, die in diesem Bereich
bis zu 106 verschiedene Bindesequenzen von 7Aminosäuren
präsentieren [4]. Aus diesen Bibliotheken wurden
Virus-Klone isoliert, die primäre humane Endothelzellen sehr
viel effizienter infizieren als wt AAV-2. Die Technik der Herstellung
und Verwendung von Virus-Bibliotheken zur
Klonierung von zielgerichteten AAV-2 Vektoren stellt einen
Meilenstein in der viralen Vektorentwicklung dar. Als positiver
Nebeneffekt zeigte sich, dass genetische Modifikationen
in dem Bereich der Rezeptorbindestelle des AAV-2 Kapsids
den neutralisierenden Effekt von humanen Serum Antikörpern
reduzieren [6]. Dies sollte eine systemische Applikation
von AAV-2 Vektoren erleichtern. Eine zweite Domäne auf
dem AAV-2 Kapsid wurde identifiziert, die die Infektiosität
und Gentransduktion mit AAV-2 beeinflusst [2]. Sie zeigt
eine Phospholipase-Aktivität und ist für die Infektiosität des
Virus nach Eintritt in die Zelle essentiell. Die Aufklärung der
molekularen Funktionen dieser Aktivität im Infektionsprozeß
ist Gegenstand weiterer Untersuchungen.
Das von uns entwickelte Helferplasmid - pDG - zur Herstellung
von AAV-2 Vektoren ermöglicht eine helfervirusfreie
Produktion von AAV-2 Vektoren. Dieses wurde dahingehend
erweitert, dass AAV-2 Vektoren in das Kapsid eines
jeden von sechs beschriebenen AAV Serotypen (AAV-1
bis AAV-6) verpackt werden können [3]. Dies erweitert
das Spektrum der durch AAV transduzierbaren Zellen und
ermöglicht eine Administration von Vektoren, auch wenn
neutralisierende Antikörper gegen einen bestimmten
Serotyp vorliegen. Die mit verschiedenen AAV Kapsiden
pseudotypisierten AAV Vektoren werden gegenwärtig für
Abteilung F010
Tumorvirologie
den kardialen Gentransfer, sowie für eine nasale Vakzinierungsstrategie
verwendet.
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] *Rohr, UP., *Kronenwett, R., Grimm, D., Kleinschmidt, J. and
*Haas, R. (2002) Primary human cells differ in their susceptibility
to rAAV-2-mediated gene transfer and duration of reporter gene
expression. Journal of Virological Methods 105, 265-275.
[2] *Girod, A., Wobus, C., * Zadori, Z ., *Ried, M., *Tijssen, P.,
Kleinschmidt, J.A. and *Hallek, M. (2002) The VP1 capsid protein
of the adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase
A2 domain required for virus infectivity. Journal of General Virology
83, 973-978.
[3] Grimm, D., *Kay, M.A. and Kleinschmidt, J.A. (2003) Helper
virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production
of adeno-associated virus vectors of sertoypes 1 to 6. Molecular
Therapy 7, 839-850.
[4] Müller, O.J., *Kaul, F., *Weitzman, M.D., *Pasqualini, R.,
*Arap, W., Kleinschmidt, J.A. and *Trepel, M. (2003) Random
peptide libraries displayed on adeno-associated virus to select
for targeted gene therapy vectors. Nature Biotechnology 9,
1040-1046.
[5] Kern, A., Schmidt, K., Leder, C., Müller, O., Wobus, C.E.,
*Bettinger, K., *Von der Lieth, C.W., King, J.A. and Kleinschmidt,
J.A. (2003) Identification of a heparin-binding motif on AAV-2
capsids. Journal of Virology 77, 11072-11081.
[6] *Huttner, N.A., *Girod, A., *Perabo, L., *Edbauer, D.,
Kleinschmidt, J.A., *Buning, H., and *Hallek, M. (2003) Genetic
modifications of the adeno-associated virus type 2 capsid reduce
the affinity and the neutrali ing effects of human serum antibodies.
Gene Therapy 10, 2139-2147.
Patentanmeldungen
Für Expression in Eukaryonten optimierte HPV16-L1 und HPV16-
L2 kodierende DNA Sequen en. Deutsche Patentanmeldung 100
55 545.4-41. Müller, M., Leder, C., Kleinschmidt, J., Sonnenwald,
U., Biemelt, S. (2002)
AAV-Helferplasmide zur Helfervirus-freien Verpackung und
Pseudotypisierung von AAV-Vektoren. Deutsche Patentanmeldung
101 20 265.2 Kleinschmidt, J., Grimm, D. (2002)
Random peptide library displayed on AAV vectors. US patent application
60/455,594. Kleinschmidt, J., Kaul, F., Müller, O., Trepel,
M., Leder, C. (2003)
Improved AAV vector for gene therapy. Europäische Patentanmeldung
03 013 169.2. Kleinschmidt, J., Müller,O. (2003)
AAV-Vektor-Verpackungsplasmide für Helfervirus-freien Herstellung
pseudotypisierter AAV-Partikel über Einzeltransfektion.
Deutsche Patentanmeldung 101 37 283.3. Kleinschmidt, J.,
Grimm, D. (2003)
Hochschulschriften
F. Sonntag: Funktionelle Charakterisierung von kurzen basischen
Sequenzen in den Kapsidproteinen des adeno-assoziierten Virus
Typ 2. Diplom, Fakultät für Biologie, Universität Heidelberg, 2002.
S. Bleker: Herstellung rekombinanter Adenoviren des Typ 5,
welche die rep-und cap-Gene des adeno-assoziierten Virus des
Typ 2 exprimieren. Diplom, Fachbereich Biologie/Chemie,
Universität Bremen, 2002.
C. Leder: Prophylaktische und Therapeutische DNA-Immunisierung
gegen das Humane Papillomvirus 16. Dissertation,
Fachbereich Chemie der Universität Hannover, 2003.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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