MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
II. 4. 2 Protein-Kinase-Assays im Mikroarray-
Maßstab
Für die funktionelle Charakterisierung von Proteinen wurden
diverse Kinase-Assays an den Mikroarray-Maßstab adaptiert.
Dabei wurden überwiegend Kinasen ausgewählt, die an
der Regulation von Zelltod und Zell-Zyklus beteiligt sind.
Eine Quantifizierung der enzymatischen Assays wird mit Hilfe
von statistischen Auswertungsprogrammen durchgeführt.
Diese Assays basieren auf der Inkorporation von radioaktivem
Phosphat in die immobilisierten Proteine. Erstmalig identifizierte
Phosphorylierungen werden mit Hilfe von Massenspektrometrie
verifiziert. Anschließend wird die Interaktion
zwischen einer Kinase und ihrem Substrat in zellulären Assays
auf ihre in vivo-Relevanz überprüft.
II. 4. 3 Peptid-Arrays
V. Stadler, S. Fernandez, M. Beyer, T. Kühlwein,
T. Seeberg, K. Leibe, A. Nesterov, K. König,
T. Felgenhauer, R. Bischoff, F. Breitling
Viele Krankheiten, wie z.B. die Borreliose, sind je nach Patient
sehr unterschiedlich ausgeprägt. Ein Grund hierfür
könnten unterschiedliche Immunantworten sein. Um etwa
die gegen Borrelia burgdorferi gebildeten Antikörper möglichst
umfassend nachweisen zu können, werden alle Proteine
dieses Bakteriums benötigt. Da dies technisch schwierig
ist, wollen wir in einem chemischen Ansatz beliebige
Proteine als einander überlappende Peptide herstellen.
Diese hochkomplexen Peptid-Arrays werden durch kombinatorische
Synthese mit Hilfe eines abgewandelten Farblaserdruckers
synthetisiert. Dabei werden die 20 verschiedenen
Aminosäuren in einer Art „festem Lösungsmittel“
immobilisiert und so 20 verschiedene Toner hergestellt.
Ein modifizierter Farblaserdrucker verschickt diese Toner zu
ihrem Bestimmungsort, an dem die Aminosäuren durch Erhitzen
mobilisiert werden und hierdurch an den Träger
koppeln. Die Wiederholung der Kopplungszyklen erzeugt
ein Peptid Array (sehr ähnlich der Merrifield Synthese). Alternativ
kann statt eines Laserdruckers ein Computerchip verwendet
werden, um die Aminosäurenpartikel an definierten
Orten auf einem Träger zu applizieren [42]. Diese Entwicklung
sollte den Stand der Technik auf diesem Gebiet signifikant
verbessern (Patentanmeldung EP1140977A2; [43]).
II. 4. 4 Hybridom-Antikörper
S. Lüttgau, G. Moldenhauer, T. Kühlwein, F. Breitling
Monoklonale Antikörper sind für die Grundlagenforschung
und die Diagnostik unverzichtbar. Gleiches gilt neuerdings
auch für menschliche Antikörper als Therapeutika. Für die
Suche nach neuen Antikörper-Spezifitäten eignen sich die
auf bakteriellen Systemen beruhenden Rekombinanten
Antikörper ausgezeichnet, diese Systeme besitzen aber
Schwachpunkte insbesondere in der Antikörperproduktion
und in der Stabilität der Antikörperfragmente. Deshalb wollen
wir die Vorteile der Hybridomtechnologie (stabile, in
großen Mengen produzierte Antikörper) und der Rekombinanten
Antikörper (effiziente Suche nach neuen Spezifitäten
durch Oberflächen-präsentierte Antikörper) miteinander
verbinden.
Hierauf zielt das Projekt zur Selektion von humanen Antikörpern
mit Hilfe von Antikörper-Präsentation auf der Oberfläche
von in vitro kultivierten Hybridomzellen. Hierfür werden
die Gene für die variablen Antikörperregionen mittels
homologer Rekombination mit loxP- und FRT-Stellen flankiert
Abteilung B050
Molekulare Genomanalyse
und dann die Vielfalt der Antikörpergene durch sukzessive
spezifische Rekombination integriert. Zur Selektion aus der
Bibliothek von Hybridomzellen werden die auf der Zelloberfläche
präsentierten Antikörper eingesetzt, wobei jede Zelle
ihren spezifischen Antikörper präsentiert (Patentanmeldung
EP1298207A1).
In einem alternativen Ansatz wurde eine Myelomzelllinie
hergestellt, die sehr viele Protein-G-Moleküle auf der Oberfläche
präsentiert. Auf der Oberfläche einer hiervon abstammenden
Hybridomzelle werden Antikörper präsentiert, die
(mit gebundenem Antigen) sehr effizient im FACS sortiert
werden können. Dies erspart die arbeitsaufwändige Suche
nach Antikörperspezifitäten und das Subklonieren, das in
der konventionellen Hybridom Technologie unumgänglich
ist. (Patentanmeldung EP1141271A1, lizensiert an die Firma
Abeome)
II. 5 Bioinformatik
II. 5. 1 Bioinformatik- und Statistik-Methoden zur
Daten-Erfassung und -Analyse
W. Huber, A. Buneß, M. Ruschhaupt, A. Poustka
In Zusammenarbeit mit: A. v. Heydebreck, R. Spang, M. Vingron
(MPI für Molekulare Genetik, Berlin); U. Mansmann (Universität
Heidelberg); J. Rahnenführer, T. Lengauer (MPI Informatik,
Saarbrücken); R. Gentleman (Harvard, USA); S. Dudoit (University
of California Berkeley, USA); R. Irizarry (Johns Hopkins University,
Baltimore, USA); S. Teichmann (MRC Cambridge, UK); L.
Füzesi (Pathologie, Universität Heidelberg); D. Rocke (University
of California Davis, USA); Febit (Mannheim); IBM Research
(USA).
In der Abteilung Molekulare Genomanalyse werden mittels
Hochdurchsatz-Applikationen große Datenmengen generiert.
Zu ihrer Auswertung setzen wir aktuelle Methoden
des Daten- Mining und der computergestützten Datenanalyse
ein, da es entscheidend ist, die Informationen statistisch
abgesichert zu analysieren. Dies gilt besonders für
krankheitsorientierte Fragestellungen.
Die Verwendung von Technologien, die auf Microarrays
basieren, ist eine wesentliche Komponente der funktionellen
Genomanalyse, die von der Abteilung MGA durchgeführt
wird. Systematische Microarraystudien generieren
erhebliche Datenmengen. Informationen über die untersuchten
Patienten, Gewebe, die histopathologische Tumorcharakterisierung,
die verwendeten Arrays und die darauf
repräsentierten cDNA-Klone sowie experimentelle Protokolle
müssen erfasst, aktualisiert und ausgewertet werden.
Qualitätskontrolle und Standardisierung dieser Daten
sind grundlegende Voraussetzungen für die wissenschaftliche
Publikation der Experimente.
Die Unterscheidung zwischen signifikanten Expressionsmustern
und stochastischen Fluktuationen wird durch eine integrierte
statistische Datenanalyse gesichert [44-46]. In der
nachfolgenden bioinformatischen Analyse werden die Ergebnisse
an Hand von molekularen Datenbanken interpretiert,
die Informationen über bereits bekannte Genexpressionsmuster,
funktionelle Genannotationen, Krankheitsassoziationen
oder Gen-Netzwerke enthalten [47,48]. Zu einem
erheblichen Teil erhalten wir aber auch Informationen
über Gene, deren Funktionen noch völlig unbekannt
sind. Diese werden in der Abteilung auf ihre zellulären Funktionen
untersucht, um ihren Nutzen als Zielgene für die
klinische Diagnostik und neue Therapieansätze zu ermitteln.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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