MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Mit Hilfe dieses Ansatzes wurden mehrere Mutationen im
zentralen Nervensystem gesetzt. Wir haben das CREB-Gen
mit Hilfe des Nestin-Promoters für die Expression der Cre-
Rekombinase während der Entwicklung inaktiviert oder
postnatal durch Expression unter Kontrolle des CaMKIIα-
Gens oder des Dopamin-1 Rezeptorgens [4]. Wird das CREB-
Gen früh in der Entwicklung in Abwesenheit von CREM
inaktiviert, so beobachten wir ausgedehnte Apoptosen im
zentralen Nervensystem. Wird das CREB-Gen nach der
Geburt inaktiviert durch entsprechende Wahl der
Expressionskassette für die Expression der Cre, sehen wir
im CREM-/- Hintergrund progressive Neurodegeneration in
ausgewählten Regionen des Hippocampus und des
dorsolateralen Striatums [4]. Diese Ergebnisse weisen auf
die Rolle dieser Proteine in der Regulation des zellulären
Überlebens von Neuronen hin und geben mögliche Hinweise
auf die Entwicklung der Huntington’schen Erkrankung.
Wir betrachten diese Mäuse als wertvolles Mittel, um die
Abläufe zu definieren, die für das Überleben von Neuronen
wichtig sind. Um diese Funktion genauer zu definieren,
führen wir ausgedehnte Expressionsprofilanalysen mit
Oligo-DNA-Chips durch [11]. Auf diese Weise konnten wir
starke Veränderungen im Cholesterinstoffwechsel der Hirnzellen
erkennen - die mRNAs für alle Cholesterin synthetisierenden
Enzyme sind bei stark erhöhtem Cholesterin erniedrigt
- und viele der Gene, die an der oxydativern Phosphorylierung
beteiligt sind, sind signifikant erniedrigt. Für
diese Analysen war die sog. ‘gene set enrichment analysis’,
wie sie vor einigen Monaten für die Interpretation von
Expressionsprofilanalysen vorgeschlagen wurde, extrem
hilfreich.
Neben der Phosphorylierung von CREB am Serinrest Ser133 beobachteten wir eine Phosphorylierung am Ser142 . Wir
konnten zeigen, daß diese Modifikation für die circadiane
Uhr wichtig ist. Im suprachiasmatischen Nukleus (SCN) wird
CREB nicht nur an Ser133 , sondern auch an Ser142 phosphoryliert. Um die Signifikanz dieser Modifikation in vivo
zu definieren, haben wir eine Punktmutation in der Maus
an Ser142 erzeugt, sodaß keine Phosphorylierung mehr ablaufen
kann. Licht-abhängige Phasenverschiebung sowie
Expression von Zielgenen von CREB sind in der CREBS142A Mutante stark abgeschwächt. Diese Beobachtungen zeigen
eine neue phosphorylierungsabhängige Regulation der
CREB-Aktivität an [12].
Der PACAP-type-I-receptor (PAC1) ist ein im G-Protein
gespeicherter Rezeptor, dessen Funktion und Beeinflussung
des cAMP-abhängigen Signalwegs wir durch Mutationen
charakterisiert haben [13, 14]. Mäuse ohne PACAP
im Hippocampus zeigen eingeschränktes assoziiertes Lernen,
ähnlich wie Dm-Mutationen im PACAP-verwandten
Gen amnesiac!
Analyse der Funktion des Rezeptors für
Glukokortikoide, Mineralokortikoide und
Östradiol
T. Belz, S. Berger, J. Elzer, E. Greiner, M. Kenzelmann,
A. Kleyman, S. Ridder, C. Ronzaud, W. Schmid,
B. Stride, J. Tuckermann, M. Vujic, T. Wintermantel
Die Wirkung von Steroiden wird über spezifische Rezeptoren,
die die Transkription von Zielgenen aktivieren oder
hemmen, vermittelt. Kortikosteroide kontrollieren die Expression
von überlappenden Genen durch zwei verwandte
Rezeptoren [15]. Der Glukokortikoidrezeptor ist in der
Abteilung A020
Molekularbiologie der Zelle I
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Lage, Glukokortikoide und Mineralokortikoide zu binden
[15]. Ein spezifischer enzymatischer Mechanismus, der zur
Inaktivierung von Glukokortikoiden in bestimmten Zielzellen
wie z.B. der Niere führt, garantiert, daß in diesen Zielgeweben
nur Mineralokortikoide an den Mineralokortikoidrezeptor
binden können. Im zentralen Nervensystem und
im Gefäßsystem können Kortikosteroide zur Aktivierung
beider Rezeptoren führen.
Mäuse ohne Glukokortikoidrezeptor sterben kurz nach der
Geburt wegen schwerer Atelektase der Lunge und wegen
fehlender Aktivierung glukoneogenetischer Gene. Tiere
ohne Mineralokortikoid-Rezeptor sterben wegen extremen
Salzverlustes kurz nach der Geburt. Wir vermuten, daß Mineralokortikoide
die Stabilität bzw. Aktivität des Natriumkanals
in einer bisher unbekannten Weise regulieren [16]. Wichtige
Einblicke in die Regulationsmechanismen des Glukokortikoidrezeptors
konnten durch eine von uns erzeugte
funktionsselektive Mutation im Rezeptor erreicht werden
[17]. Diese Mutante erlaubte die antiinflammatorische Wirkung
des Rezeptors genauer zu definieren. Der dimerisierungsdefekte
Glukokortikoidrezeptor ist in der Lage, die
Aktivierung von Genen für Zytokine nach LPS-Behandlung
in T-Zellen und in Makrophagen zu verhindern [18]. Überexpression
des Rezeptors durch Einführung zusätzlicher
Kopien über Transgenese mit künstlichen Hefechromosomen
führte zu Tieren, die eine vermehrte Resistenz gegenüber
dem endotoxischem Schock nach LPS-Behandlung
aufzeigen [19]. Mit dieser funktionsselektiven Mutation
überprüfen wir z.Z. die außerordentlich wichtige Frage,
ob selektive Rezeptorliganden die gewünschten
antiinflammatorischen Wirkungen zeigen, ohne die Nebenwirkungen
wie z.B. Osteoporose aufzuweisen. Die bisher
gewonnenen Daten zeigen, daß bakterielle Infektionen und
der daraus folgende endotoxische Schock durch den dimerisierungsdefekten
Glukokortikoidrezeptor nicht aufgehoben
werden kann (M. Vujic, W. Schmid, unveröffentlicht).
Für diese Analyse ist die von uns weiter entwickelte Methodik
des ‘expression profiling’ mit hoher Sensitivität mit
Affymetrix-Chips von großem Nutzen [20]. Interessanterweise
ist der Rezeptor auch in der Lage, Vorgänge zu beeinflussen,
die ausschließlich im Zytoplasma ablaufen [21].
Mäuse ohne Glukokortikoidrezeptor im Gehirn zeigen eine
stark beeinträchtigte Regulation der HPA-Achse [22-25]
Eine weitere Mutation, bei der der Glukokortikoidrezeptor
nicht nur im zentralen Nervensystem, sondern auch in Zellen
der vorderen Hypohphyse inaktiviert wurde, führen zur
frühen Lethalität der Mäuse bei stark verändertem Thymus
und der Niere. Diese Veränderungen sind vermutlich bedingt
durch die etwa tausendfach erhöhten Spiegel von
Kortikosteroiden im Serum. Um die Funktion des Rezeptors
im ZNS genauer erfassen zu können und die frühe Lethalität
zu vermeiden, entwickeln wir eine induzierbare Mutation
mit Hilfe eines Fusionsproteins der Cre-Rekombinase mit
der Ligandenbindungsdomäne des Östradiolrezeptors (G.
Erdmann, unveröffentlicht). Mit Hilfe dieser regulierbaren
Cre-Rekombinase erwarten wir, daß wir die Mutation unter
Vermeidung der frühen Lethalität besser studieren können.
Diese Maus soll uns Einblicke in die Funktion des Rezeptors
in der Entwicklung der Sucht gewähren. Analyse der
Rolle des Glukokortikoidrezeptors in der Sucht nach Inaktivierung
im ZNS zeigt, daß Glukokortikoid-abhängige Regulation
von großer Bedeutung für die Ausbildung der Sucht
ist [26].
Leberspezifische Inaktivierung des Glukokortikoidrezeptors
führt zur starken Beeinträchtigung des Wachstums [27].