MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
der Polzellen, die im Verlauf der Gonadenbildung verloren
gehen, nicht für das Ausmaß der Reduktion der dlg-Testes
verantwortlich gemacht werden können, untersuchten wir,
ob eventuell andere mesodermale Zellen nicht in der Lage
sind, in die dlg-Gonaden inkorporiert zu werden. Wie Mark
van Doren (Johns Hopkins University) vorschlug, analysierten
wir die mesodermalen Zellen, welche Sox100B exprimieren
und das posteriore Ende der embryonalen Testes
umschließen, jedoch in Ovarien fehlen. Wir fanden, daß in
dlg-Larven Sox100B Zellen, obwohl sie zu Beginn des Stadiums
14 anwesend sind, verschwinden, sobald sie die ”forming
testes” erreichen. Diese Befunde weisen darauf hin,
daß dlg eine kritische Rolle für die letzten Schritte bei der
Migraiton der Sox100B mesodermalen Zellen spielt. Untersuchungen
an frühen larvalen Testes zeigen, daß im Vergleich
zu Wildtyp-Testes, die dlg-Testes eine reduzierte
Anzahl von Stammzellen der Keimbahn, die den ”hub” umgeben,
welcher am anterioren Ende liegt, enthalten. Weiterhin
wiesen die Testes zahlreiche degenerierende Cysten
von Spermatogonien am posterioren Ende auf. In den Testes
von Wildtyp-Larven weist die Verteilung von Sox100B- und
Dlg-Protein ein dynamisches Muster auf, das von ubiquitärem
Auftreten in allen mesodermalen Zellen bis zu einer
begrenzten Lokalisation in nur wenigen Zellen reicht. In
frühen larvalen Testes finden wir eine intensive Sox100B
Expression im Zytoplasma von mesodermalen Zellen, die
zwischen den Keimbahnzysten lokalisiert sind. Danach beschränkt
sich die Anwesenheit von Sox100B auf die großen
Cystenkerne auf der Oberfläche der Testes. Ähnliches
gilt für das Dlg-Protein, das zunächst in allen mesodermalen
Zellen vorhanden ist und in späten Larvenstadien die anteriore
Seite der mesodermalen Zellen, welche die posteriore
Hälfte jeder Spermatozyten-Cyste einschließt, umgibt. Mit
Blick auf die Rolle, welche Sox9 für die Determination und
Differenzierung der Testes in Mammalia spielt, lassen unsere
Daten vermuten, daß Sox100B, für das Drosophila Homologe
zu Sox9-Protein der Mammalia, in Assoziation mit
Dlg Keimzellproliferation und Differenzierung der Testes von
Drosophila steht.
4. Funktion von Importin-α während Oogenese
und Spermatogenese von Drosophila
I. Török, B.M. Mechler
In Zusammenarbeit mit: I. Kiss, M. Gorjánácz und T. Szlanka, Biological
Research Center, Hungarian Academy of Sciences,
Szeged, Ungarn
Die Analyse einer Nullmutation des Importin-α2 Gens, die
D14 interstitielle Deletion, zeigt, daß diese Mutation zu einer
rezessiven Sterilität der Weibchen führt, die charakterisiert
ist durch die Blockade des Nährzell-Oozyten-Transportes
während der Oogenese. In Eikammern von Wildtyp ist
das Imp-2-Protein gleichmäßig im Zytoplasma der Nährzellen
und etwas schwächer entlang der Oozytencortex, verteilt.
Behandlung von Wildtyp-Eikammern mit Cytochalasin D,
zerstört die in vivo Assoziation von Imp-α2 mit F-Actin und
führt zu seinem Transfer in die Nährzellkerne und seine
Freisetzung von der Oocytencortex. Bindungsstudien zeigen,
daß die Interaktion von Imp-α2 mit F-Actin, dem ”nonmonomeric
actin”, die Anwesenheit von NLS-Peptiden erfordert.
Die Blockierung des Nährzell-Oocyten-Transportes
in imp-α2 D14 Eikammern, ist die Folge des Verschlusses des
Ringkanals, welcher aus den Zytoplasma-Brücken zwischen
Nährzellen und der Oocyte aufgebaut ist. Immunohistochemische
Untersuchungen zeigen, daß unter den bereits
bekannten Komponenten des Ringkanals, das Kelch-Pro-
Abteilung A040
Entwicklungsgenetik
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
tein nicht in den Ringkanal von imp-α2D14-Mutanten deponiert
werden kann. Da loss-of-function Mutation von kelch
einen ähnlichen ”dumpless” Phänotyp zeigen, vermuten
wir, daß Imp-α2 eine kritische Rolle für die Funktion von
kelch ausübt, indem es seine Deponierung an den Ringkanal
während seiner Zusammenlagerung reguliert [5].
In einer zweiten Publikation beschreiben wir das Synthesemuster
der drei Importin-α Proteine im Verlauf der Spermatogenese
[6]. Jedes der drei Imp-α-Proteine wird während
einer spezifischen und begrenzten Periode der Spermatogenese
exprimiert. Wir finden eine starke Expression
von Imp-α2 in spermatogonialen Zellen, die sich in Spermatozyten
fortsetzt und bis zum Abschluß der Meiose andauert.
In wachsenden Spermatozyten scheint die intrazelluläre
Lokalisation von Imp-α2 von der Zellwachstumsrate
abzuhängen. In Testes von Puppen ist Imp-α2 ausschließlich
in den Spermatozytenkernen vorhanden, ist aber in
den Spermatozyten adulter Testes im Zytoplasma lokalisiert.
Sowohl die Imp-α1- als auch die Imp-α2-Expression
setzen zu Beginn der Meiose ein und endet während der
Differenzierung der Spermatiden. Die Expression von Impα1
reicht bis zum Beginn der Elongationsphase, während
die Expresson von Imp-α3 bis zum Abschluß der Kernkondensation,
der Zeitpunkt, zu dem sich die Spermatiden
individualisieren, dauert. Während der Meiose sind Imp-α1
und Imp-α2 im Karyoplasma verteilt und dort partiell assoziiert
mit der Kernspindel, jedoch nicht mit dem Spindelaster.
In der Telophase aggregieren sie um das Chromatin.
Während der Differenzierung des Spermienkopfes sind
Imp-α1 und Imp-α3 im Kern. Diese Daten sprechen dafür,
daß jedes Imp-α2-Protein eine bestimmte, zum Teil überlappende
Funktion im Verlauf der Spermatogenese von
Drosophila ausübt, die möglicherweise auch den Import
von Proteinen in den Kern, sowie die Organisation von
Mikrotubuli und weitere bisher noch nicht bekannte Prozesse,
einschließt [6]. Kürzlich durchgeführte Analysen mit
einer Reihe von Substitutionen und Deletionen von spezifischen
Domänen im Imp-α2-Protein zeigten, daß dieses
Protein eine wichtige Funktion für das Ringkanal-”assembly”
sowie für das “assembly/disassembly” der mitotischen Spindel
während der frühen syncytialen Kernteilungen, ausübt.
5. Drosophila Genomorganisation und Erstellung
eines Deletionskits
H. Schenkel, C. De Lorenzo, D.H. Lankenau, J. Marhold
und B.M. Mechler
In Zusammenarbeit mit: F. Lyko, DKFZ; M. Ashburner, Department
of Genetics, University of Cambridge, UK; G. Reuter, Institut
für Genetik, Martin Luther Universität, Halle; A. Rasmuson-
Lestander, Umeå University, Schweden; P. Maroy, Department of
Genetics, Attila Jozsef University, Szeged, Ungarn; E. Hafen,
Institut für Zoologie, Universität Zürich, Schweiz; G. Pflugfelder,
Universität Mainz
Obwohl das Genom von Drosophila vollständig sequenziert
wurde, ist es notwendig, seine Organisation im Detail zu
analysieren und Mutationen exakt individuellen
Transkriptionseinheiten zuzuordnen. Unsere Arbeitsgruppe
hat Untersuchungen durchgeführt, um genetisch und
molekular eine Reihe von Mutationen zu identifizieren, die
einen Lokus betreffen, der zwei ineinander liegende Gene
trägt, nämlich das snRNP SmD3 und das Ornithinine Decarboxylase
Antizyme Gen [4]. Hinzu kommt, daß wir eine neue
Technik der homologen Rekombination in Drosophila einsetzen,
um das Gen, welches für das Nucleosome Assembly