MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
beiden Systeme vorgenommen. Zur Erprobung wurden die
L1- und E7-Gene des humanen Papillomavirus 16 (HPV-16)
als Transgene gewählt. Ferner wurden durch die Konstruktion
von HSV-1/HPV-Amplicon-Hybridvektoren alternative,
vom klassischen Weg abweichende Anwendungsmöglichkeiten
für Amplicons aufgezeigt. Die verwendeten Transgene
sind mögliche Kandidaten zur Immunisierung gegen HPV-16,
welches als ein wichtiger Faktor in der Entwicklung des
Gebärmutterhalskrebses angesehen wird. Anhand des Modellantigens
L1 von HPV-16 wurden Verpackungseffizienz,
Helfervirus-Kontamination und Transgenexpression nach Verpackung
mit den Helferviren HSV-1 LaL sowie mit HSV-1
BAC beurteilt.
Das HSV-1 LaL System lieferte die größte Menge an verpackten
Amplicons (~106 transducing units/ml), wies aber
auch mit ~1% die höchste Helfervirus-Kontamination auf.
Nur nach Verpackung mit HSV-1 BAC wurden reine Amplicon-
Stammlösungen erhalten, aber mit 10-fach geringerer Partikelzahl.
Die Transgenexpression, gemessen mit L1, war wesentlich
stärker, wenn HSV-1 LaL-verpackte Amplicon-Präparationen
zum Einsatz kamen. Dies ist möglicherweise auf
die transaktivierende Wirkung viraler Proteine zurückzuführen,
die über das kontaminierende HSV-1 LaL Helfervirus in
der infizierten Zelle zur Verfügung stehen. Diese zusätzliche
Transaktivator-Funktion fehlt den HSV-1 BAC verpackten,
helferfreien Amplicon-Vektoren. Für die aus beiden Verpackungssystemen
erhaltenen Amplicon-Präparationen wurde
gezeigt, dass mit diesen Vektoren eine Expression des Transgens
erzielt werden kann, die direkt mit der für die Infektion
verwendete Viruspartikelmenge korreliert. Es gelang ferner
die Produktion von HPV-16 VLPs (virus-like particles) nach
Dichtegradienten-Sedimentation elektronenmikroskopisch
zu dokumentieren.
Ein weiterer Schwerpunkt der Forschungsanstrengungen
lag in der Gestaltung alternativer HSV/HPV-Hybrid-Amplicon-Vektoren.
Dazu wurden die herpesviralen Proteine VP22
(trafficking protein) und das Virushüllprotein Glykoprotein
C (gC) erfolgreich mit dem E7-Protein aus HPV-16 fusioniert.
Zweck der Fusion war, die Immunogenität des E7-
Proteins zu verstärken. Durch die Fusion von E7 mit VP22
sollte die interzelluläre Transportfunktion des VP22-Proteins
genutzt werden, um E7 auch in benachbarte Zellen zu
bringen und damit in vivo eine verstärkte Immunreaktion
zu induzieren. Das VP22/E7-Fusionsprotein wurde als integraler
Bestandteil des Amplicon-Viruspartikels identifiziert,
aber keine interzelluläre Transportbefähigung festgestellt.
Die Fusion von E7 mit gC führte zur gewünschten Präsentation
von E7 auf der Virushülle des Amplicon-Partikels. Die
Ergebnisse der bisherigen Arbeiten können zu einer Verbesserung
der bestehenden Verpackungssysteme beitragen
und damit der Anwendung von Amplicon-Vektoren in der
Gentherapie den Weg ebnen helfen.
Die wissenschaftlich-technologische Zusammenarbeit (WTZ)
mit der Slowakei, Projekt-Nr. SVK 00/006 mit dem Titel
“Erzeugung attenuierter Herpes simplex Virusvektoren zur
humanen Gentherapie und Vakzination” wurde mit Gastwissenschaftleraufenthalten
im Jahre 2002 und 2003 fortgeführt.
Ziel ist die Aufklärung der Rolle spezifischer Mutationen
im essentiellen Hüllprotein, Glykoprotein B (gB) für die
Pathogenität von Herpes simplex Virus 1(HSV-1)-Stämmen,
und ferner die Etablierung einer gB-Deletionsmutante, die
als neuer HSV-1 Vektor des Typus “Single-Cycle-Replication-
Virus” eingesetzt werden kann. Im Berichtszeitraum wurden
zwei gB-exprimierende Zelllinien etabliert, die für die Darstellung
von gB-Deletionsmutanten notwendig sind. Zur
Abteilung F030
Virale Transformationsmechanismen
Zeit laufen Versuche zur Darstellung der gB-Deletionsmutanten.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Publikationen (2002-2003) (* = externer Koautor)
[1] Song, L.*, Chaudhuri, M.*, Chang, M.*, Wu, Z.*, Diallo, H.*,
Knopf, C. W. und Parris, D.S*. (2003). Contribution of the 3’ to
5’ exonuclease activity of herpes simplex virus type 1 DNA polymerase
to the fidelity of DNA synthesis. J. Biol. Chem. 279:
18535-18543.
Tumorvirus-spezifische Vakzinierungsstrategien
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. L. Gissmann, DKFZ; Dr. H. W.
Zentgraf, DKFZ; Dr. J. Kleinschmidt, DKFZ; Prof. Dr. H. Müller,
Universität Leipzig; Dr. M. Kast, Loyola University Chicago, USA;
Prof. Dr. U. Sonnewald und Dr. S. Biemelt, IPK Gatersleben; Prof.
Dr. H. Will, Heinrich-Pette Institut Hamburg.
Weltweit können 15-20% der Tumorerkrankungen mit viralen
und bakteriellen Krankheitserregern in Zusammenhang
gebracht werden. Allein das Zervixkarzinom repräsentiert
dabei mit jährlich einer halben Million neuer Fälle die zweithäufigste
Krebsart bei Frauen. An erster Stelle der Risikofaktoren
für das Zervixkarzinom steht die Infektion mit
humanpathogenen Papillomviren (HPV). Ziel der Arbeitsgruppe
ist es, virusspezifische Vakzinierungsstrategien zu
entwickeln sowie vorhandene Strategien auf ihre Wirksamkeit
zu untersuchen. Im Vordergrund stehen dabei immuntherapeutische
Fragestellungen. Zur Zeit wird in mehreren
unterschiedlichen Ansätzen der Entwicklung einer
Papillomavirus-spezifischen Vakzine nachgegangen:
Verbesserte Induktion und Nachweis von HPV
16 E7-spezifischen zytotoxischen T-
Lymphozyten nach DNA- und Protein-basierter
Vakzinierung
N. Michel, M. Müller
DNA Vakzinierung ist ein vielversprechender Ansatz eine
humorale sowie zelluläre Immunantwort zu induzieren [1].
Zur Immuntherapie HPV 16-assoziierter Erkrankungen ist
das E7 Protein von besonderer Bedeutung, da es in allen
HPV 16-positiven Tumoren exprimiert wird. Leider besitzt
E7 jedoch nur geringe Immunogenität, besonders wenn
es in Form einer DNA Vakzine verabreicht wird. Wir konnten
durch gezielte Veränderung die Immunogenität von E7,
insbesondere die Fähigkeit zur Induktion einer zytolytischen
Immunantwort deutlich erhöhen. Erhöhte Immunogenität
von E7 wurde erzielt durch Fusion mit klassischen und nichtklassischen
Proteinexportsignalen, Stabilisierung des E7 Proteins
durch Fusion mit einem Trägerprotein sowie Akkumulation
von E7 im endoplasmatischen Retikulum [2,3]. Unsere
Beobachtungen zeigen, dass die molekularen Mechanismen,
welche die E7 Immunogenität beeinflussen sehr komplex
sind. Möglicherweise spielt dabei ein verstärkter Transfer
von Antigen von DNA transfizierten Zellen zu professionellen
antigen-präsentierenden Zellen (cross priming) eine wesentliche
Rolle. Alternativ könnten die Modifikationen des E7
Proteins auch zum Verlust einer spezifischen, immunsupprimierenden
Funktion von E7 geführt haben.
Ein weiteres Ziel dieses Projektes war es, E7-Proteine direkt
zur Induktion einer zellulären Immunantwort zu verwenden.
Zu diesem Zweck wurden monoklonale anti-E7 Antikörper
entwickelt, die in der Lage sind Immunkomplexe mit E7 zu
bilden. Zur Zeit wird untersucht, ob diese Komplexe zytolytische
Immunantworten auslösen. Um die Untersuchungen
zu ermöglichen, wurden insgesamt vier unterschiedliche