MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Elektronenspektroskopie für die Analyse von
Nano-Strukturen
Koordination: M.F. Trendelenburg, H. Tröster,
H. Spring
H. Tröster, L.H. Monteiro-Leal, L. Campanati Araujo,
M. Pelajo Machado, A. Marques Cianciarullo
M. Wießler, H.C. Kliem, C. Granzow, E. Mark (E080)
In Zusammenarbeit mit W.W. Franke, J. Kartenbeck (A010,
DKFZ); W. Schlegel (E040, DKFZ); M. Pawlita (F020, DKFZ);
E. Delain (Inst. Gustave Roussy, Villejuif/Frankreich); S. Fakan
(Univ. Lausanne/Schweiz); P. Oudet, P. Schultz, C. Crucifix,
J. Witz (Univ. Strasbourg/Frankreich); Steinbeis Transfer
Zentrum (STZ) Analyt. EM in Biomedizin u. Biotechnologie Heidelberg,
H. Kohl (Univ. Münster), J. Mayer (RWTH Aachen) ,
M. Schwarz (Orthopädie, Univ. Klinikum Mannheim) , S. Milz
(Anatomie, Univ. München), M. Hafner (FH Technologie,
Mannheim).
Grundlage des Electron Spectroscopic Imaging ist die
inelastische Elektronenstreuung in den inneren Atomschalen,
d.h. es wird ein Hüllelektron durch Energieübertragung
angeregt oder ionisiert, als Folge ergibt sich ein
Element charakteristischer Energieverlust des Strahlelektrons.
Sind in einem elektronenmikroskopischen Präparat
Elemente in einer nachweisbaren Masse vorhanden, so entstehen
im Energieverlustspektrum definierte Absorptionskanten.
Aus diesen Absorptionskanten lassen sich dann
Rückschlüsse auf das Element, das Hüllenelektron und die
Konzentration ziehen (vgl. Darstellung in Abb.1).
Hauptprojekte: Forschung und Entwicklung
1. Quantifizierung erforderlicher Objekt- und Analyse Parameter
biomedizinischer Proben für das Electron
Spectroscopic Imaging (ESI) und die Electron Energy
Loss Spektroskopie (EELS). Hauptsächlich für folgende
Präparattypen: Gespreitete DNA/Nukleinsäurekomplexe
und nichtkontrastierte Ultradünn-Schnitte durch fixierte
Zellen. An diesen Präparaten soll die Elementverteilung
von Strukturgebundenem Phosphor quantitativ dargestellt
werden.
2. Schritte zur Quantifizierung des Phosphor (P)Gehalts definierter
viraler Genome. Ein besonderes Problem bei der
Quantifizierung von Phosphor Signalen ist die Definition
des Präparat Untergrund Signals. Um die Relation der
Beiträge von spezifischem Phosphat (P) Signal gegenüber
dem unspezifischen Untergrund Signal zu definie-
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Strukturelle Genanalyse
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
ren, haben wir verschiedenen virale Proben auf EM-Träger
Kohlenstoff Membranen adsorbiert. Hierbei konnte
ein speziell konfigurierter Präparatetyp entwickelt werden,
der es erlaubt Virus Partikel, die DNA oder RNA in
einer Packungsdichte von 3-5 P-Atomen/um² enthalten,
in Bezug auf das P-spezifische Signal reproduzierbar
zu analysieren. (Abb 1: C,D) [1-3; PT 2, PT 3]
3. Ein neues Verfahren zur Elementspezifischen Darstellung
von Immunogold markierten Ultradünnschnitten. Das
gegenwärtig intensivst genutzte EM-Markierungsverfahren
besteht in der Verwendung von Antikörpergekoppelter
Nanogold Partikel. Abgesehen von den bekannten
Problemen der Erreichbarkeit der Antigene für
die verwendeten gekoppelten Immuno-Gold-Proben
ergibt sich sehr häufig das Problem, dass die genaue
Position der spezifisch gebundenen Gold Partikel in vielen
Fällen nicht genau definiert werden kann, da der
Präparatuntergrund partikuläre Bereiche ähnlich hoher
Elektronendichte aufweist, wie die der zur Immundedektion
verwendeten Nanogold Partikel. Durch die von
uns entwickelte Methode kann der Kontrastbeitrag der
Nanogold Partikel selektiv gegenüber dem Präparatkontrast
reproduzierbar ermittelt werden. Hiermit ist eine
neue Möglichkeit gegeben, Immunogold markierte EM-
Präparate quantitativ auszuwerten. [PT 3]
4. Eine besondere Bedeutung für den Einsatz der EM Spektroskopie
kann für die direkte Detektion und Lokalisation
von zur Therapie applizierten Bor-Verbindungen in
Patienten Tumoren erwartet werden (Haritz et al., J.
Radiation Oncol. Biol. Phys. 28,1175, 1994). Seit mehreren
Jahren wird das Verfahren der Bor-Neutronen Einfang
Therapie (BNCT: Boron Neutron Capture Therapy)
im Rahmen eines EG-Vorhabens weiterentwickelt. In den
nächsten Jahren werden mehr und mehr speziell konfigurierte
(meist höher konzentrierte Pharmaka /
Diagnostica) mit höherem Bor Anteil (vgl. Feakes et. al.
PNAS 96, 6406,1999) verwendet werden. [4,7; PT 1]
5. Automatisierte Mehrfach EM-Immundetektion: Ein neuer
Ansatz zur spektroskopischen Abbildung Gold-markierter
Proben. Das derzeit häufigste verwendete Verfahren
der ultrastrukturellen Immundetektion ist die
Verwendung Nanogold-gekoppelter Antikörper. Im
Routineeinsatz tritt häufig das Problem auf, dass die
Nanogoldpartikel nur mit großen Schwierigkeiten über
einem kontrastierten „dichten“ Präparatuntergrund erkannt
werden können. Mit der von uns ausgearbeite-
Abb. 2.: Ein neues Verfahren zur automatisierten Auswertung von EM Ultradünnschnitten nach simultaner 2-fach Immun-Markierung.
Schema der Systemkonfiguration (A-D): ZEISS EM 912 Omega, mit 2K x 2K Slow Scan CCD Kamera (PROSCAN), in Verbindung mit
analySIS Software 3.1 (SIS) und Bildverarbeitungsschritte (s. Text). E-F: zeigen das ausgewertete Präparate (E) und nach der
Bilderverarbeitung (F, Programm Goldfinder).