MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Wir haben zunächst sechs Gene für die weitere Analyse
ausgewählt. Um in ihre weitgehend unbekannten Funktionen
Einblick zu erhalten, schalten wir sie durch RNAi in
geeigneten Zellinien aus, suchen mit 2-Hybrid-Screens nach
Bindungspartnern, und prüfen rekombinant exprimierte einzelne
Proteindomänen auf ihre biochemischen Eigenschaften.
Um diagnostisch brauchbare Marker zu erhalten [1,2],
müssen Expressionsunterschiede rasch und an möglichst
vielen Patientinnen bestimmt und mit den histopathologischen
Befunden und dem klinischen Verlauf der Erkrankung
verknüpft werden. Dazu produzieren wir die codierten Proteine
rekombinant in Bakterienzellen und gewinnen gegen
sie gerichtete Antikörper, die zur immunhistologischen Färbung
von Gewebeschnitten eingesetzt werden.
Hochkomplexe diagnostische Peptidarrays
F. R. Bischoff, S. Fernandez, K. Leibe, A. Nesterov
In Zusammenarbeit mit Frank Breitling; Thomas Felgenhauer,
Mario Beyer, Annemarie Poustka, Volker Stadler, Abteilung
Molekulare Genomanalyse, DKFZ.
Es wird ein Verfahren zur Herstellung hochkomplexer
Peptidarrays entwickelt, das auf einem modifizierten Laserdrucker
beruht, der statt des normalen Farbtoners Partikel
druckt, in welche die aktivierten Aminosäuren für die Peptidsynthese
eingebettet sind. Durch Erwärmen werden die
Partikel geschmolzen, die darin eingeschlossenen Monomere
freigesetzt und die Kopplungsreaktion gestartet. Durch
wiederholte Merryfield-Zyklen von Koppeln, Waschen und
Abspalten der Schutzgruppe kann eine große Zahl unterschiedlicher
Peptide gleichzeitig auf einer Trägerfolie synthetisiert
werden. Die Möglichkeit, alle Teilschritte der Synthese,
auch die Verdampfung des Lösungsmittels, kontrollieren
zu können, ergibt ein einfaches, robustes, schnelles,
preiswertes und gegenüber dem bisherigen Stand der
Technik bedeutend verbessertes Verfahren zur Herstellung
komplexer Peptidarrays.
Arrays dieser Art können z.B. dazu benutzt werden, den
Antikörperstatus von Patienten zu bestimmen. Durch die
Analyse von Peptidbibliotheken, welche die Proteome von
Krankheitserregern oder das des Menschen repräsentieren,
erhoffen wir Färbemuster zu erhalten, die uns Status
und Verlauf von Krankheiten anzeigen. Ferner können mit
den Arrays Substrate von Proteinkinasen gesucht werden,
wobei etwa 100 000 Peptide 1000 menschliche Genprodukte
als überlappende Peptide repräsentieren. Sobald
man diese Substrate identifiziert hat, kann ein entsprechender
Array von Kinase-Substraten aktive Signalwege in verschiedenen
Geweben oder Zellinien nachweisen.
Bisher haben wir 15 Aminosäure-„Toner“ entwickelt, die in
einer Dichte von >100 000 Spots pro 20 x 20 cm auf
Abb. 2: Selektive Toner-Ablagerung auf einem Chip mit Elektroden
von 100 x 100 µm
Abteilung A070
Molekulare Biologie der Mitose
einen festen Träger aufgedruckt werden können. Zusammen
mit dem modifizierten Farb-Laserdrucker, der am Fraunhofer-Institut
für Produktionstechnik und Automatisierung
entwickelt wird, sollte die Synthese hochkomplexer
Peptidarrays (>100 000 Peptide pro Blatt von 20 x 20 cm)
demnächst möglich sein.
Als Alternative zum Laserdrucker benutzen wir einen Chip,
um Toner-Partikel selektiv auf definierte Flächen von 100 x
100 µm aufzubringen [3]. Dieses Verfahren sollte es ermöglichen,
noch deutlich mehr verschiedene Peptide auf einer
kleinen Fläche zu synthetisieren.
Der Ran-Signalweg im intrazellulären Transport
F.R. Bischoff, M. Sjölinder, L. Schleicher, H. Ponstingl
In Zusammenarbeit mit E. Hurt, Biochemiezentrum der Universität
Heidelberg; C. Granzow und M. Kopun-Granzow, Abt. Molekulare
Toxikologie, DKFZ.
Die kleine GTPase Ran regelt mit ihren Kontrollfaktoren
und Bindungspartnern den Transport von Proteinen und
RNA durch die Porenkomplexe der Kernmembran. Zahlreiche
Proteine binden spezifisch die aktive Form, RanGTP. Wir
haben die Hauptkomponenten des Systems und mehrere
Transportfaktoren aus menschlichen Zellen und aus Hefe
isoliert und die Rolle von Ran bei der Bildung von Transportkomplexen
am Ausgangspunkt und ihrer Dissoziation am
Ziel untersucht. Ran liegt auf der cytoplasmatischen Seite
der Kernmembran vorwiegend als inaktives RanGDP vor, im
Kern hingegen als aktives RanGTP. RanGAP, ein Aktivator
der Nukleotidhydrolyse, ist verantwortlich für die Inaktivierung
im Cytoplasma, die Aktivierung im Kern bewirkt ein
Nukleotidaustauschfaktor, RCC1.
Die Transportfaktoren reagieren auf die Anwesenheit oder
Abwesenheit von RanGTP, indem sie mit der Fracht beladen
werden oder sie durch Dissoziation der Transportkomplexe
„abladen“. Importine und Exportine verhalten
sich dabei gegensätzlich: Frachtproteine im Cytoplasma
mit einem klassischen Kernlokalisations-Signal binden in
Abwesenheit von RanGTP über einen von mehreren
Importin-α-Adaptoren an Importin-β, das für den eigentlichen
Import zuständig ist. Die Translokation durch die Kernpore
folgt einem bisher ungeklärten Mechanismus, der offenbar
ohne Nukleotidhydrolyse auskommt. Im Kern wird
der Import durch Dissoziation des importierten Komplexes
beendet. RanGTP bindet mit hoher Affinität an Importin-β
oder einen der verwandten Importfaktoren und löst dort
eine Konformationsänderung aus, die Importin-α und Substrat
freisetzt. Gleichzeitig wird dadurch die Rückbildung
der Import-Komplexe verhindert.
Im Gegensatz zu den Importinen binden Exportine ihre
Frachten im Kern unter Ausbildung eines Komplexes mit
RanGTP. Dieser sehr feste Exportkomplex wird ohne Hydrolyse
des gebundenen GTP ins Cytoplasma befördert. Dort
sind exportierte Komplexe zunächst nicht für die Stimulation
der GTP-Hydrolyse durch RanGAP1 zugänglich. Hier greifen
das kleine cytoplasmatische RanBP1 und das RanBP2
der cytoplasmatischen Fasern an den Kernporen ein: Sie
binden an RanGTP an einer anderen Stelle als die Transportfaktoren
und ändern die Gestalt des Exportkomplexes. Nun
erst wird die Hydrolyse des Ran-gebundenen GTP durch
RanGAP1 stimuliert, das frei im Cytoplasma vorkommt oder
über ein Peptid SUMO-1 an RanBP2 gebunden ist. Die GTP-
Hydrolyse verhindert, daß sich der exportierte Komplex
wieder zurückbildet, denn die Transportfaktoren haben nur
eine sehr geringe Affinität für RanGDP. Damit sind die be-
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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