MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
mit anderen Mitgliedern der AP1-Familie als auch Homodimere,
während c-Fos nur Heterodimere bildet. Nur die Dimer
binden an DNA und aktivieren die Transkription. Deregulation
von AP1 kann zu onkogenen Transformationen führen.
Bis jetzt wurde die Wechselwirkung zwischen Jun und Fos
nicht in vivo beobachtet. Um sie sichtbar zu machen, wurden
c-Jun und c- Fos mit verschiedenen autofluoreszierenden
Proteinen fusioniert und in HeLa-Zellen exprimiert. Die
Wechselwirkung der beiden Proteine wurde dann durch
Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) nachgewiesen
(Abb. 2). Hierbei werden korrelierte Fluktuationen
der Fluoreszenz in zwei Farbkanälen beobachtet, die nur
dann auftreten, wenn die beiden Proteinen aneinander
binden [4]. Außerdem wurde die Mobilität der Proteine
wie oben beschrieben durch FCS charakterisiert.
Wir konnten zeigen, dass für eine Lokalisierung der
Transkriptionsfaktoren im Zellkern sowohl die DNA-Bindungsals
auch die Dimerisierungsdomäne notwendig sind. Bei der
Kotransfektion von Zellen mit rot bzw. grün fluoreszierend
markiertem c-Jun und c-Fos konnte eine eindeutige Zunahme
der Kreuzkorrelationsamplitude beobachtet werden,
die in Abwesenheit der DNA-Bindungs- und Dimerisierungsdomänen
nicht auftrat. Die Fluktuationen, die dem Fos/
Jun-Dimer entsprechen, liegen in einem langsamen Zeitbereich,
der der Bewegung der Chromatinkette entspricht.
Dies deutet darauf hin, dass die Fos/Jun Dimerisierung erst
bei Bindung an die DNA stattfindet.
Abb. 2: Autokorrelation des roten und grünen Fluoreszenzkanals
(rot, grün) und Kreuzkorrelation (blau) eines Fusionsproteins aus
RFP und GFP in lebenden HeLa-Zellkernen.
Untersuchungen viraler Eintrittsmechanismen in
die Zelle mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
am Beispiel von SV40
S. Bernacchi, W. Waldeck, J. Langowski
In Zusammenarbeit mit Jürgen Kleinschmidt (DKFZ)
Das zur Polyoma-Familie gehörende SV40-Virus ist das einfachste
bekannte doppelsträngige DNA-Virus. Onkogen in
Abteilung B040
Biophysik der Makromoleküle
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
verschiedenen Tiermodellen, dient es als Modellsystem für
die Untersuchung von Funktionsmechanismen von Tumorviren.
SV40 wird nach Endocytose zum endoplasmatischen
Retikulum transportiert; der weitere Verlauf des Transports
zum und im Zellkern ist noch unklar. Eine wichtige Fragestellung
in diesem Zusammenhang ist, wo und wann das virale
Capsid sich auflöst und in welcher Form das SV40-Genom
im Zellkern transportiert wird.
Wir untersuchen in diesem Zusammenhang mit Hilfe der
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) i) die Diffusion
des Virus außerhalb der Zelle und die Bindung an den Rezeptor,
ii) die Bildung des Endosoms im Zytoplasma, iii) den
intrazellulären Transport des Endosoms und iv) den Transport
in den und im Zellkern. Hierzu haben wir Capsidproteine
chemisch mit Fluorophoren und das virale Genom, das als
Minichromosom vorliegt, durch autofluoreszierende Histonkonstrukte
[6] markiert. Erste Ergebnisse zeigen, dass die
Diffusion intakter Viren und freier Capsidproteine in der
Zelle deutlich unterschieden werden kann; auch die Diffusion
des fluoreszenzmarkierten Genoms im Zellkern konnte
beobachtet werden.
Flexibilität und Assemblierung von
Intermediärfilamenten
N. Mücke, R. Kirmse, J. Langowski
In Zusammenarbeit mit Tatjana Wedig and Harald Hermann
(DKFZ) sowie Laurent Kreplak und Uli Aebi (Biozentrum Basel,
Schweiz)
Intermediärfilamente sind die Hauptkomponenten des Zytoskeletts
von Metazoen. Im besonderen scheinen sie für
die mechanische Stabilität der Zellen verantwortlich zu sein.
Aus diesem Grund haben wir Intermediärfilamente mittels
Rasterkraftmikroskopie untersucht, um neue Informationen
über ihre Struktur und die mechanischen Eigenschaften
zu erhalten. Hierfür wurden Filamente aus rekombinantem
humanen Vimentin in vitro gebildet, und dann auf Glimmer
gebracht und in Luft sowie in Flüssigkeit vermessen. Für
eine standard-elektronenmikroskopische Darstellung werden
Filamente mit Glutaraldehyd fixiert und mit Uranylacetat
kontrastiert. Solchermaßen drastische Behandlung kann in
der Rasterkraftmikroskopie durch Messungen in Flüssigkeit
vermieden werden, d.h. die Filamente können direkt in
physiologischem Puffer vermessen werden. Nur wenn man
die Präparate in Luft analysiert, muß noch fixiert werden,
um ein Auflösen der Filamente beim Entfernen des Salzes
zu verhindern.
In unseren Experimenten wurde aus den zweidimensionalen
Konturen der IFs die Persistenzlänge der Filamente als Maßzahl
für ihre Flexibilität bestimmt (Abb. 3). Es wurde dazu
ein neues Verfahren entwickelt, mit dem die Persistenzlänge
aus dem mittleren quadratischen End-zu-End-Abstand und
dem mittleren Biegewinkel der Filamente sehr genau ermittelt
werden kann. Mit diesem Verfahren konnten auch die
Bedingungen bestimmt werden, in denen die Konformation
der Filamente auf der Oberfläche im Gleichgewicht ist, so
dass die gemessenen Eigenschaften nicht durch schnelle
Bindung an die Oberfläche (‚trapping’) beeinflusst werden.
Unter diesen Bedingungen fanden wir, dass Humanvimentin
Filamente mit einer Persistenzlänge von 1 µm bildet [27].
Dies ist eine relativ starre Struktur, jedoch flexibel verglichen
mit der Steifheit eines Vimentintetramers. Wir nehmen
daher an, dass bei der Verformung von Vimentin die
tetrameren Untereinheiten aneinander vorbei’gleiten’ können.
Die Konsequenzen aus diesem Befund für die Struktur