MDCK-MRP2 - Dkfz

402
Zelldifferenzierung (F050)
Leiter: Prof. Dr. med.vet. Angel Alonso
Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Gastwissenschaftler
Dr. Ignacio G. Bravo (8/02- , Span. Kultusministerium)
Dr. Kirsten Kabsch (- 6/02, DFG)
Doktorandinnen
Kerstin Leykauf (-12/03, DFG)
Myriam Grüner (6/02- , DKFZ)
Diplomand
Adriano Lavecchia (6/02- )
Techniker
Jürgen Fischer
Michaela Hipp
Das E5 Protein der menschlichen Papillomaviren.
Struktur und Funktion
A. Alonso, I.G. Bravo, K. Kabsch
In Kooperation mit: Prof. Dr. J. Reed, DKFZ; Priv. Doz. Dr. J.
Schenkel, Institut für Physiologie, Universität Heidelberg; Priv.
Doz. Dr. M. Kaszkin, Institut für Pharmakologie, Universität
Frankfurt; Prof. Dr. M. Dürst, Frauenklinik der Universität Jena.
Betrachtet man die Genomstruktur der menschlichen Papillomaviren,
so findet man eine Reihe von offenen Leserahmen
zwischen den bekannten Genen E2 und L2. Über
die Bedeutung dieser potentiellen Proteine ist wenig bekannt;
unbekannt ist auch, ob solche Leserahmen überhaupt
in vivo transkribiert werden. In den “high-risk” HPVs
dieser Region ist nur ein offenes Leseraster enthalten, das
für ein Protein mit ungefähr 80 Aminosäuren kodiert. Dieses
Protein wurde E5 genannt. E5 von HPV16, 18 und 33 ist
in der Lage, Zellen zu transformieren, nicht aber zu malignisieren.
Darüber hinaus kooperiert E5 mit E7 und verstärkt
damit die Transformationseigenschaften des E7 Proteins.
E5 kann nicht als ein Onkogen betrachtet werden, kann
aber die Eigenschaften der HPV-infizierten Zellen so verändern,
dass es zu einer Instabilisierung dieser Zellen kommt.
Diese Destabilisierung ist die Basis für die spätere Einwirkung
der E6 und E7 Onkogene.
HPV16-E5 ist ein stark hydrophobes Protein, 83 Aminosäuren
lang und vorwiegend in Endosomen, Golgi und ER lokalisiert.
Die hohe Hydrophobizität hat bis heute die Produktion
von Antikörpern erschwert, so dass Experimente entweder
mit Epitop-gebundenen E5 Proteinen oder mit in vitro syn-
Abb. 1: Lokalisation des
HPV2a Proteins in transfizierten
Zellen. CHO Zellen
wurden mit GFP-E5
(HPV16) DNA transfiziert
und nach 48 Stunden mit
Paraformaldehyd fixiert.
Immunofluoreszenz
wurde mit Antikörper
gegen den cis-Golgi
Marker GM130 (a) oder
den trans-Golgi Marker
58K (b) durchgeführt.
HPV16 E5 lokalisiert vorwiegend
im trans-Golgi
(gelbe Farbe).
F050
Zelldifferenzierung
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
thetisierten Peptidfragmenten durchgeführt werden müssen.
In einer ersten Reihe von Experimenten haben wir versucht,
das HPV16 E5 Protein in ausreichender Menge für zirkuläre
Dichroismus Analysen zu produzieren. Obwohl E5-transfizierte
Zellen eine starke Synthese des E5 Proteins aufwiesen,
war es nicht möglich, das Protein in Lösung zu bringen.
Eine Alternative zur Synthese in eukaryotischen Zellen ist
eine in vitro Synthese des Proteins als Peptidteil. Peptide,
die eine der drei hydrophoben Domänen des Proteins enthalten,
wurden synthetisiert und in TFA gelöst. Durch Zugabe
von Wasser wurde die Hydrophobizität des Mediums
verringert, um eine CD-Analyse der Peptide unter Membranähnlichen
Bedingungen durchzuführen. Die Analysen ergaben,
dass die erste und die dritte Domäne des Proteins in
der Lage waren miteinander zu interagieren und dass diese
Interaktion zu einer Stabilisierung der sekundären Struktur
der Peptide führte. Darüber hinaus konnte nachgewiesen
werden, dass die erste Domäne eine starke alpha-Helix aufweist,
was schlüssig ist mit der Idee, dass diese Domäne
die wirkliche TM Region des Proteins enthält [1].
Zwei wichtige Funktionen des Proteins sind in den letzten
Jahren identifiziert worden: i) Rolle von E5 bei der Ligandbedingten
Apoptose. ii) Down-Regulation der MHC Klasse
I Moleküle an der Plasmamembran.
Unsere Experimente haben eine aktive Rolle des HPV16 E5
Proteins bei der Inhibition der Ligand-bedingten Apoptose
in menschlichen Keratinozyten nachgewiesen. Zellen, die
HPV16 E5 unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors
exprimieren, und Vektor-transfizierte Zellen wurden verwendet,
um die Rolle von E5 bei der Apoptose zu untersuchen.
Die Expression des viralen Proteins resultierte in
einer starken Reduktion der TRAIL- und FasL-bedingten
Apoptose in menschlichen Zellen. Interessanterweise beruhte
diese Reduktion auf zwei verschiedenen Mechanismen.
In TRAIL-behandelten Zellen verhinderte E5 die DISC-
Formation und damit die Weiterleitung eines Apoptosesignals.
In FasL-behandelten Zellen beruhte die Wirkung
von E5 auf der verminderten Anzahl von Fas Rezeptoren
an der Zelloberfläche. Interessanterweise wurde eine ähnliche
Protektion gegenüber TRAIL Ligand auch in Mausfibroblasten
beobachtet, die konstitutiv HPV16 E5 exprimieren.
Es handelt sich also nicht um einen Zelltyp-spezifischen Ef-