MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt C
Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention
1.6 Interventionsstudie in japanischen Frauen
In Zusammenarbeit mit T. Hanaoka, National Cancer Research
Institute, Tokio, Japan.
In einer Interventionsstudie in Japan wurde die Ausscheidung
von εdA im Urin in nichtrauchenden postmenopausalen
Frauen in Nordjapan untersucht [6]. Dabei wurde der Erfolg
einer diätetischen Beratung, die Salzeinnahme zu
reduzieren und höhere Vitamin C- und Karotin-Mengen zu
sich zu nehmen durch Fragebögen und biochemischen
Analysen bestimmt. Aus einer großen Kohorte wurden 30
postmenopausale Frauen (60 - 69 Jahre alt) in der Interventionsgruppe
und 30 Frauen in der Kontrollgruppe untersucht.
Vor der Intervention war der εdA-Spiegel im Harn
positiv mit der ausgeschiedenen Kochsalz-Konzentration
korreliert; ebenso korrelierte εdA mit der Einnahme von ω-
6 vielfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA). Die Ergebnisse
dieser Pilotstudie stützen die Annahme, dass das
ausgeschiedene εdA im Harn von DNA-Schäden herstammt,
die durch Kochsalz und Helicobacter pylori über chronisch
entzündliche Prozesse im Magen ausgelöst werden. Ein bereits
nachgewiesener Zusammenhang zwischen der Aufnahme
von ω-6 PUFA-reicher Nahrung und erhöhter
Etheno-Addukt-Bildung in Lymphozyten weiblicher Probanden
wurde in dieser Studie weiter bestätigt. Die biologische
Relevanz von εdA und εdC als Biomarker in Biomonitoring-
und klinischen Studien wird derzeitig in prämenopausalen
Frauen (Leukozyten-DNA) in Abhängigkeit vom
Östradiol-Metabolismus und Fettsäureaufnahme untersucht.
1.7 Erhöhte Etheno-DNA-Addukt-Spiegel und
Mutationsrate in transgenen Mäusen mit
verminderter G6PD-Enzymaktivität.
In Zusammenarbeit mit K. Felix und S. Janz, National Cancer Institute,
NIH, Bethesda, USA.
Das von G6PD-generierte NADPH spielt eine wichtige Rolle
beim Schutz der Zelle gegenüber oxidativem Stress. Ein
möglicher Zusammenhang mit der Auslösung von somatischen
Mutationen und einer G6PD-Defizienz wurde in einem
transgenen Mäusestamm untersucht, der ein ‘low efficiency’
Allel der G6PD und einen Shuttle-Vektor pUR288 zum Nachweis
von Mutationen trägt. Das Hirn männlicher Tiere zeigte
wegen der auf 13 % erniedrigten G6PD-Aktivität deutliche
Störungen des Redox-Gleichgewichtes, d.h. eine dreifache
Verminderung des Verhältnisses von reduzierten zu
oxidierten Glutathion. Eine Anhäufung promutagener
Etheno-Addukte (13-fach für εdA und 5-fach für εdC) wurde
nachgewiesen, die mit einer dreifach erhöhten somatischen
Mutationsrate einherging. Die Ergebnisse belegen die wichtige
Schutzfunktion der G6PD in der Säugetierzelle [7].
1.8 DNA-Addukte in OXYS-Ratten
In Zusammenarbeit mit G. Nevinsky, Novosibirsk Institute of Biochemistry,
Russland
Dieser Inzucht Wistar-Rattenstamm wurde mit Hilfe eines
galaktosereichen Futters auf erhöhte Kataraktbildung selektioniert
und zeigt eine vererbbare Überproduktion von reaktiven
Sauerstoffspezies. Damit ist dieses Tiermodell für Untersuchungen
human chronisch degenerativer Krankheiten,
wie Kataraktbildung, Skoliose und Tumorentstehung geeignet.
In einer Pilotstudie wurde die DNA aus der Leber
von 3 bis 15 Monate alten OXYS- und Wistar-Ratten untersucht
und εdA und εdC mit Hilfe von 32P-Postmarkierung bestimmt. Die Adduktspiegel zeigten keine Unterschiede,
wenn 3 Monate alte OXYS- und Wistar-Ratten verglichen
wurden. In 15 Monate OXYS-Ratten verglichen mit gleichaltrigen
Wistar-Ratten oder 3 Monate alten OXYS-Ratten
Abteilung C010
Toxikologie und Krebsrisikofaktoren
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
waren die Adduktspiegel signifikant höher. Weiterhin wurden
LPO-induzierte DNA-Schäden im Gehirn untersucht und
dazu Gefrierschnitte von OXYS- und Wistar-Ratten von Hirngewebe
auf εdA immunhistochemisch untersucht. Die Ergebnisse
zeigten deutlich erhöhte Werte im Gehirn von 15
Monate alten OXYS-Ratten und sogar in einigen der 3 Monate
alten Tiere. Unsere Ergebnisse zeigen deutliche, dass
in der Leber und im Gehirn dieses OXYS-Ratten-Stammes
ein oxidativer Stress und Lipidperoxidation vorherrschen,
die die Bildung dieser promutagenen DNA-Läsionen verursachen.
Weiterhin wurde ein altersabhängiger Anstieg der
Adduktspiegel demonstriert.
1.9 Messmethode für das Malondialdehyd
modifizierte DNA-Addukt M 1 dG
M 1 dG wurde bereits früher in menschlichen Geweben entdeckt
und gilt damit als ein weiterer viel versprechender
Marker zur Bestimmung von LPO-induzierten DNA-Schäden.
Mit dem Ziel M 1 dG in kleinen DNA-Proben (weniger als 10
µg) zu bestimmen und die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen,
wurde von uns eine Nachweismethode entwikkelt,
die auf Immunanreicherung, 32 P-Postmarkierung und
HPLC beruht. Die folgenden Schritte erhöhten deutlich
die Reproduzierbarkeit und Nachweisempfindlichkeit: 1. Eine
Optimierung zur Immunanreicherung mit einem monoklonalen
Antikörper (MAb D 10A1). 2. Eine einzige
Markierungsreaktion des vorgereinigten M 1 dG 3'-Monophosphats
zum 5'-Monophosphat bei pH 6,8. 3. Der Zusatz
von O 4 -Äthylthymidin als interner Standard und 4.
Vorreinigung des markierten Addukts an eine
Polyäthylenimin-Minisäule vor der HPLC-Analyse. Mit diesem
verbesserten Analysenprotokoll kann eine Nachweisgrenze
von 6 Addukte pro 10 9 Nukleotide in 10 µg DNA erreicht
werden. Mit unserer Methode mit hoher Nachweisempfindlichkeit
und Spezifität konnten Hintergrundspiegel
von M 1 dG humanen Brust- und Leberproben reproduzierbar
nachgewiesen werden. Die Methode eignet sich deshalb
bestens für Anwendungen im Bereich des humanen
Biomonitoring und für Studien der Molekularepidemiologie
[8].
1.10 Nachweismethode für O4-Äthyl-Desoxythymi din (O4-etdT) und seine Bildung in Rauchern
J. Nair, R. Godschalk, A. Risch
In Zusammenarbeit mit M. Wießler und C. Kliem, DKFZ; F.J. van
Schooten, Universität Maastricht, Niederlande; P. Drings, K.
Kayser, H. Dienemann, Thoraxklinik, Heidelberg
Neben dem Nachweis von Etheno-DNA-Addukten wurde
auch eine verbesserte Methode zur quantitativen Bestimmung
von O 4 -etdT entwickelt. Unter den Dutzend verschiedener
Alkylierungsprodukte in der DNA, die z.B. durch karzinogene
N-Nitrosoverbindungen gebildet werden, zählt O 4 -
etdT zu den wichtigen promutagenen DNA-Läsionen, die
hauptsächlich AT→ GC Punktmutationen hervorrufen.
Obwohl O 4 -etdT anfänglich in relativ niedriger Ausbeute
gebildet wird, reichert es sich wegen der unvollständigen
DNA-Reparatur in der Zelle an und spielt deshalb in der
Karzinogenese eine wichtige Rolle. Eine erhöhte Ausscheidung
von äthylierten DNA-Basen wurde im Harn von Zigarettenraucher
nachgewiesen. Um die Äthylierung der DNA
in Zielorganen von Rauchern nachzuweisen, wurde eine
32 P-Postlabelling-Immunanreicherungs-Methode für O 4 -
Äthyl-Thymidin (O 4 -etT) entwickelt. O 4 -etT-3'-Monophosphat
wurde synthetisiert, aufgereinigt und durch LC, MS,
ESI-MS und NMR charakterisiert. Zur Validierung der Metho-