MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Zell-autonome Funktionen von c-Jun, c-Fos und
FosB bei der Regulation von Zellproliferation und
Antwort auf genotoxische Substanzen
A. Kolbus, H. Bierbaum
In Kollaboration mit Ingrid Herr, Klaus-Michael Debatin, Sven
Baumann, Sören Eichhorst, Sabine Kirchhoff, Peter Krammer,
DKFZ; Martin Schreiber und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare
Pathologie Wien, Österreich; Michael Karin, UC San Diego,
La Jolla, USA
Die Synthese der Fos und Jun Proteine wird nach Behandlung
von Zellen mit DNA-schädigenden Substanzen (Strahlung,
chemische Karzinogene, z.B. alkylierende Agenzien)
stark erhöht [1,3]. Dies lässt darauf schließen, dass diese
Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle bei der zellulären
Antwort auf solche Stressfaktoren spielen. In Fibroblasten,
die aus c-Jun oder c-Fos Knockout-Mäusen etabliert wurden,
konnte diese Annahme experimentell bestätigt werden.
c-Fos-defiziente Zellen weisen eine Hypersensitivität
gegenüber UV Strahlung und chemischen Mutagenen (z.B.
Alkylantien) auf. Dieser Effekt scheint jedoch auf Fibroblasten
beschränkt zu sein, da verschiedenste Mutagene und
physiologische Induktoren von Apoptose in Thymozyten
und aktivierten T-Zellen aus Wildtyp und c-Fos-defizienten
den programmierten Zelltod mit vergleichbarer Effizienz induzieren
[5,6]. Zellen aus c-Jun-defiziente Mäusen verlieren
die Fähigkeit, nach Behandlung mit UV Strahlung oder
chemischen Mutagenen in Apoptose zu gehen [7]. Die
Unterschiede zwischen Wildtyp und Mutantenzelle beruht
auf dem Verlust der Induktion von Fos/Jun-abhängigen
Genen, darunter das Gen, das für CD95-L kodiert. CD95-L
bindet an das Zelloberflächenantigen CD95 und es kommt
nachfolgend zur Aktivierung einer Serie von Caspasen, an
deren Ende die DNA Fragmentierung und Zelltod steht.
c-Jun spielt daher eine essentielle Rolle bei der Synthese
von Apoptose-auslösenden Proteinen (z.B. CD95-L), während
die Komponenten des CD95-spezifischen Signalwegs,
der zur Auslösung von Apoptose führt, unabhängig von c-
Jun exprimiert werden [7]. Neben der „Stress“-induzierten
Apoptose in Fibroblasten spielt AP-1-abhängige Induktion
von CD95-L auch bei der induzierten Apoptose in aktivierten
T-Zellen eine wichtige Rolle, wobei hier FosB als
entscheidender Dimerisierungspartner zu fungieren scheint
[8].
Funktion von JunB in vivo und in vitro
M. Schorpp-Kistner, S. Andrecht, D. Schmidt,
B. Hartenstein, J. Hess, N. Keon, S. Gack,
M. Sator-Schmitt, T. Raubinger, S. Teurich
In Kollaboration mit Norbert Fusenig, DKFZ; Emanuelle Passegue
und Erwin F. Wagner, Institut für Molekulare Pathologie Wien,
Österreich
Die Ergebnisse unserer bisherigen Arbeiten ergaben deutliche
Hinweise darauf, dass die verschiedenen Mitglieder
der Jun Proteinfamilie (c-Jun, JunB, JunD) spezifische, zum
Teil nicht-überlappende Funktionen in AP-1-abhängigen
Prozessen spielen. Diese Annahme wurde durch den spezifischen
Phänotyp der JunB knockout Mäuse unterstrichen,
der sich deutlich von denjenigen unterscheidet, die durch
den Verlust anderer AP-1 Untereinheiten (z.B. c-Jun, JunD,
Fos Proteine) hervorgerufen werden [3]. Die junB -/- Embryonen
entwickeln sich normal bis zum Tag 7.5 der Embryogenese
und sterben dann innerhalb von zwei Tagen auf
Grund von Fehlentwicklungen bei der Blutgefäßbildung der
extraembryonalen Gewebe (Dottersack, Plazenta), wo-
Abteilung A100
Signaltransduction und Wachstumskontrolle
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
durch der notwendige Transport von Nährstoffe von der
Mutter zum Embryo nicht im ausreichenden Umfang stattfindet.
Um die molekularen Grundlagen für diesen Phänotyp
aufzuklären, haben wir verschiedene in vitro Zellkultursysteme
mit Zellen aus Wildtyp und mutierten Mäusen etabliert,
darunter Fibroblasten, primäre Endothelzellen, die
anschließend durch stabile SV40 T-Antigen Expression immortalisiert
wurden (Endothelioma), und JunB-defizienten
embryonale Stammzellen (ES). Vor allem mit dem in vitro
Differenzierungssystem der ES Zellen zu sog. „embryoid
bodies“, bei denen die in vivo Defekte bei der Ausbildung
von Blutgefäßen nachgeahmt werden konnten, war es
möglich VEGF (ein Hauptregulator der Vaskulogenese und
Angiogenese) als JunB-abhängiges Zielgen zu identifizieren
[9,10]. Es zeigte sich, dass die Expression dieses Gens
unter vermindertem Sauerstoffdruck (Hypoxie), dem Hauptstimulus
von Angiogenese und Vaskulogenese, in JunBdefizienten
ES Zellen, Fibroblasten und Endothelioma fast
vollständig aufgehoben ist. Dies beruht darauf, dass JunB
direkt an den VEGF Promotor bindet, und zusammen mit
dem Transkriptionsfaktor HIF1α für die positive VEGF Expression
benötigt wird [9,10]. Neben der physiologischen
Funktion von JunB in der Vaskulogenese und Angiogenese
haben unsere Arbeiten auch deutliche Hinweise auf eine
wichtige Rolle von JunB bei der Tumorangiogenese erbracht.
Nach Injektion von ES Zellen und nachfolgender Ausbildung
von Teratokarzinomen zeigte es sich, dass Tumore,
die sich von JunB-defizienten Zellen ableiten, ein geringeres
Tumorvolumen und kaum vaskuläre Strukturen aufwiesen.
Dies ging einher mit einer stark reduzierten Expression
von VEGF in den Tumorzellen, was die Ursache für das
stark verminderte Einwandern von Blutgefäßen in den
Tumor sein könnte [9,10].
Obwohl junB-/- Embryonen in der frühen Phase der Embryonalentwicklung
sterben, ist es uns gelungen daraus
primäre Fibroblasten zu isolieren und durch spontane Immortalisierung
permanente Linien zu generieren [11,12].
Diese Zellen wurden für die Aufklärung der Rolle von JunB
in der Proliferationskontrolle und Antwort auf Strahlung
und Oncoproteine untersucht. JunB greift an zwei Stellen
im Zellzyklus regulatorisch ein: zum einen führt das Fehlen
von JunB zu einem beschleunigten Übergang der Zellen
von der G1 in die S-Phase. Dies beruht auf einer reduzierten
Expression des CDK Inhibitors p16ink einer spontan erhöhten
Expression von c-Jun. Im weiteren Verlauf der Zellzyklusprogression
kommt es in JunB-defizienten Zellen zu
einem verzögerten Übergang von S nach G2/M was mit
einer verringerten Expression und Kinaseaktivität von Cyclin A
assoziiert ist. Alle Defekte können durch Einbringen eines
JunB-ER Expressionsvektors Hormon-abhängig revertiert
werden [11,12]. Durch den Nachweis i) der Bindung von
JunB in vitro an eine CRE Sequenz im Cyclin A Promotor, ii)
der CRE-abhängigen transkriptionellen Aktivierung des Cyclin
A Promotors durch Überexpression von JunB (zusammen
mit ATF2) und iii) der verringerten AP-1 Bindungsaktivität
an das CRE Element in JunB-defizienten Zellen konnten
wir erstmals Cyclin A als direktes und positiv reguliertes
JunB Zielgen identifizieren [11,12].
Veränderte Expression von Zellzyklusregulatoren (Cyclin D1,
Cyclin A, p16) ist auch die Ursache für pathologische Veränderungen
bei der Knochenentwicklung und -homöostase
in sog. „JunB rescue“ Mäusen, die durch Einkreuzen einer
junB transgenen Mauslinie in den junB-/- Hintergrund generiert
wurden, wodurch der embryonal letale Phänotyp
wieder revertiert werden kann [13,14]. Die adulten Tiere