MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
beeinflussen könnte. Interessanterweise konnten wir zeigen,
dass beide NS1-regulierenden Kinasen PKCλ und PKCη
nach MVM Infektion in der Zelle umverteilt werden [15,17].
Dies kann zu dramatischen Veranderungen der Zellphysiologie
führen, und in Konsequenz zumindest eine Ursache
für die Veränderungen in der Zellmorphologie (cytopathischer
Effekt) sein. Deshalb steht gegenwärtig die Analyse
der NS1-induzierten Zellveränderungen im Vordergrund unserer
Untersuchungen. Kürzlich konnten wir zeigen, dass
Ab- und Umbau von Mikro- und Intermediärfilamente des
Zytoskeletts durch die virale Infektion betroffen sind, wobei
Mikrotubuli während der ganzen Infektionsdauer erhalten
bleiben (Publikation in Vorbereitung). Hierbei scheint
die Aktivität der PKCs zumindest in der Regulation von NS1
eine wesentliche Rolle zu spielen. Frühere Untersuchungen
in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass die NS1-induzierten
Zellveränderungen durch Mutationen an PKC Phosphorylierungsstellen
im viralen Protein inhibiert wurden.
Dabei reguliert PKCλ die Interaktion von NS1 mit CKIIα,
der katalytischen Untereinheit der zellularen Caseinkinase
II. Dieser NS1/CKIIα Komplex reguliert die Phosphorylierung
der Tropomyosinfilamente und bewirkt damit in dramatischer
Weise den Umbau des Zytoskeletts (Manuskript in
Vorbereitung). Aufgrund dieser Befunde haben wir semisynthetische
Toxine entwickelt, die für die transformierte A9
Zelllinie toxisch sind, von anderen Zelllinien aber toleriert
werden [Patent Nüesch und Rommelaere, 2003]. Die
Weiterentwicklung solcher Onkotoxine und ihre Applikation
durch heterologe virale Vektorsysteme sind weitere Projekte
unserer Arbeitsgruppe. Im Rahmen unserer Studien zur
Biologie der Parvoviren wurden wir auch eingeladen, an
einem Kompendium über Viren mitzuarbeiten [14].
e. Strategien zum Einsatz von parvoviralen
Komponeneten in der Gentherapie
Z. Raykov, J. Rommelaere
Das Ziel dieses Projekt besteht darin, mittels verschiedener
Strategien durch den natürlichen Onkotropismus und die
onkolytische Wirkung von Parvoviren eine Verbesserung in
der Krebstherapie zu erzielen. Dabei standen drei Fragestellungen
im Vordergrund: (i) Gegenwärtig können autonome
Parvoviren noch nicht so verändert werden, dass sie
lediglich eine gewünschte Zielzelle infizieren. Zudem ist die
Kapazität, Fremdgene einzuschleusen, limitiert. Um diese
Restriktionen zu umgehen und die gewünschten Eigenschaften
dieser Viren zu erhalten, haben wir versucht, chimäre
Viren zu entwickeln. Als Modell dienten rekombinante
Adenoviren, welche eine Expressionskassette aus dem parvoviralen
Genom enthielten. Die toxische Wirkung der konstitutiv
exprimierten Nichtstrukturproteine NS1 und NS2
bewirkte dabei, dass die Herstellung solcher chimären Viren
unmöglich wurde. Durch den gezielten Einsatz spezifischer
Antisense-Oligonukleotide konnten wir die Produktion
der toxischen Proteine soweit einschränken, dass eine Produktion
solcher Chimären ermöglicht wurde [1]. Damit konnten
wir zeigen, dass einerseits die Herstellung parvoviraler
Chimären möglich ist, andererseits der gezielte Einsatz von
Antisense-Oligos die Produktion von rekombinanten Viren
ermöglicht, welche starke Toxine exprimieren. (ii) Nichtpropagierende
autonome Parvoviren allein sind nicht in der
Lage, pre-existierende Tumoren vollständig zu beseitigen.
Um eine erfolgreiche Therapie zu erzielen, braucht man
einen Bystander-Effekt. Zu diesem Zweck wurden die Eigenschaften
autonomer Parvoviren mit dem angiostatischen
Abteilung F010
Tumorvirologie
Chemokin IP-10 potenziert und in einem murinen Hämangiosarkom-Modell
(Kaposi-Sarkom Analog) getestet. Bereits
wenige intratumorale Anwendungen dieser rekombinanten
MVMp-IP10 Viren genügten, um eine signifikante Reduktion
der primären Tumoren zu erzielen. Diese Studien wurden
in Zusammenarbeit mit Team 2 durchgeführt [3]. Unglücklicherweise
induzieren sowohl natürlich vorkommende wie
rekombinante autonome Parvoviren bereits nach wenigen
Applikationen eine starke Immunantwort im Wirt. Dies stellt
ein generelles Problem für die systemische Anwendung
solcher Agenzien dar, da sie von neutralisierenden Antikörpern
abgefangen werden. Um diesem negativen Einfluss
zu entgehen, haben wir neue Strategien zur Applikation
von autonomen Parvoviren entwickelt. (iii) Als Modell dienten
krebsbefallene Ratten. Die metastasierenden Tumoren
in der Lunge wurden durch Einspritzen einer
Hepatomzelllinie induziert. Zur Behandlung mit autonomen
Parvoviren wurde dieselbe Zelllinie mit dem Wildtyp des
Rattenvirus H-1 infiziert. Durch gezielte γ-Bestrahlung der
infizierten Zellen wurde zwar das Wachstum der Krebszellen
gestoppt, und damit eine Verbreitung der Geschwüre
verhindert, die Replikation der Parvoviren hingegen blieb
erhalten. Diese in vitro infizierten Zellen dienten dann als
Vehikel, um das therapeutische Parvovirus in das krebsbefallene
Tier zu schleusen. Mittels intravenöser Applikation
solcher Parvovirus-tragenden Vehikel konnte eine hohe
Konzentration der therapeutischen Viren in der Lunge (dem
Metastasen tragenden Organ) erzielt werden, was zu einer
bedeutenden Reduktion (60%) der bereits existierenden
Tumoren führte [27]. Gegenwärtig versuchen wir, die
gewonnenen Erkenntnisse weiter auszunutzen, um in neuen
Versuchsreihen eine optimale Wirkung zu erziehlen.
2) Parvovirus - Zielzelleninteraktionen
J.-C. Jauniaux, N. Salomé
Die autonom replizierenden Parvoviren MVM und H-1 Virus
exprimieren vier verschiedene Proteine: die Strukturproteine
VP1 und VP2, die zur Bildung des Kapsids notwendig sind,
und die Nichtstrukturproteine NS1 und NS2. Das NS1 Protein
ist essentiell für die parvovirale DNA-Amplifikation und
Genexpression. NS1 spielt darüber hinaus beim parvovirusvermittelten
Zelltod eine wichtige Rolle (s.o.). Das NS2
Protein spielt eine entscheidende Rolle beim Aufbau des
viralen Kapsids und, als mögliche Konsequenz daraus, bei
der Herstellung der einzelsträngigen Parvovirus-DNA. Es gibt
darüber hinaus Hinweise, dass NS2 die zytotoxische Wirkung
von NS1 moduliert. Die molekularen Mechanismen,
die diesen Aktivitäten zugrunde liegen, sind jedoch noch
unbekannt. Deren Aufklärung ist eines der Ziele unserer
Arbeit.
In zurückliegenden Studien haben wir nachgewiesen, dass
das NS2 Protein mit dem nukleären Exportrezeptors Crm1
interagiert und über einen Crm1-abhängigen Reaktionsweg
aktiv aus dem Kern infizierter Zellen transportiert wird. Um
die Bedeutung dieser Interaktion für den viralen Lebenszyklus
aufzuklären, wurden zwei mutierte genomische Klone
hergestellt, die CRM1-Interaktions-defiziente NS2-NES(-)
Proteine exprimieren. Die funktionelle Analyse dieser Klone
offenbarte, dass der NS2-Crm1-Komplex weder für die Synthese
der viralen Proteine (NS1, NS2, VP1 und VP2), noch
für die Produktion infektiöser Virionen benötigt wird. Aber
das Fehlen des nukleären Exports von NS2 und/oder die
starke verringerung von NS2 im Zytoplasma der infizierten
Zellen führt zur Ansammlung neu produzierter MVM-Parti-
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
377