MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
konzentration und der Anwesenheit von Linker-Histon H1
bestimmt. Dieser Abstand nimmt mit der Länge der DNA
monoton zu, was darauf hindeutet, dass sich die Arme der
Linker-DNA im Mononukleosom nicht überkreuzen. Außerdem
scheint die durch H1 induzierte, in EM-Aufnahmen
festgestellte sog. ‚Stem-Geometrie’ auch in freier Lösung
zu existieren [Tóth et al. 2001, Biochemistry 40(23):6921-
6928].
In Gegenwart von H1 und höheren Salzkonzentrationen
bildet die Nukleosomenkette reguläre sog. ‚Chromatin-fiber’-
Strukturen. Als einer der strukturbildenden Faktoren wird
hier die Neutralisierung der elektrostatischen Abstoßung
zwischen freien DNA-Bereichen durch das Linker-Histon
vermutet. Wir finden in unseren FRET-Messungen an
Mononukleosomen, dass Histon H1 den Abstand zwischen
den Linker-DNA-Enden für alle untersuchten DNA-Längen
um 5-10 Å verringert. Zunahme der NaCl-Konzentration
von 5 auf 100 mM vermindert den Abstand nur sehr wenig
(< 5Å), wogegen MgCl -Zugabe von 0-2 mM bei NaCl-
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Konzentrationen von 5 mM den Abstand monoton um bis
zu 10 Å verringert. Diese Salzeffekte zeigen sich in analoger
Weise mit oder ohne Histon H1.
Chemische Acetylierung der Histone durch Acetylphosphat
führt zu Änderungen der Geometrie der Linker-DNA. Komplette
Acetylierung aller Histone oder von H3 alleine führt
zu einer globalen Vergrößerung des Öffnungswinkels der
Linker-DNA, während Acetylierung von H4 alleine überraschenderweise
eine Annäherung der Linkerarme induziert
(Abb. 1)
Abb. 1: Abstand der Linker-DNA-Enden in rekonstituierten Mononukleosomen
als Funktion der Salzkonzentration und der DNA-
Länge. Schwarz: nicht acetyliert, rot: alle Histone acetyliert,
grün: H3 acetyliert, blau: H4 acetyliert
Rasterkraftmikroskopie von Nukleosomen und
superhelikaler DNA
M. Bussiek, J. Langowski
Um den Einfluss der Nukleosomenbindung auf die globale
Struktur von DNA zu untersuchen, haben wir einzelne auf
superhelikaler DNA rekonstituierte Nukleosomen mit Raster-
Abteilung B040
Biophysik der Makromoleküle
kraftmikroskopie (SFM) untersucht. Die Bedingungen für
diese SFM-Experimente waren in einer früheren Arbeit ermittelt
worden [18]. Aus früheren Arbeiten war bekannt,
dass DNA-Krümmungen in den Endschleifen der Superhelix
lokalisieren, und wir erwarteten bei der Bindung von
Nukleosomen einen ähnlichen Effekt.
Ein Vergleich von rekombinanten Histonen (nicht acetyliert)
und teilweise acetylierten HeLa-Histonen zeigte klare
Unterschiede zwischen den beiden Präparationen: die
HeLa-Histone waren hauptsächlich in den Endschleifen lokalisiert,
während die Nukleosomen aus rekombinanten Histonen
zusätzlich oft an Kreuzungspunkten der Superhelix zu
finden waren. Wir folgern daraus, dass Nukleosomen in
bestimmten Fällen gleichzeitig an zwei DNA-Doppelstränge
binden können, was insbesondere bei den stärker bindenden
nichtacetylierten Histonen auftritt.
In einer weiteren Arbeit haben wir systematisch die Bindung
von DNA an Polylysin-behandelte Glimmeroberflächen
für SFM-Beobachtungen in Lösung untersucht. Optimale
Bedingungen für zweidimensionale Äquilibrierung auf der
Oberfläche, sowie für ‚Einfrieren’ der Konformation
(trapping) bei verschiedenen Salz- und Polylysinkonzentrationen
konnten definiert werden [20].
Untersuchung des makromolekularen
Transports im Interphasezellkern mit
Fluoreszenzfluktuationsmikroskopie
N. Dross, J. Langowski, M. Wachsmuth, T. Weidemann
Transport und Bindung von Molekülen zu spezifischen Sites
sind essentiell für den Aufbau und die Funktion von organisierten
supramolekularen Strukturen im Zellkern. Das un
unserer Arbeitsgruppe entwickelte Fluoreszenzfluktuationsmikroskop
(FFM) erlaubt die Beobachtung der Konzentration
und Mobilität von fluoreszierenden Molekülen in vivo durch
eine Kombination von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie
(CLSM), Fluoreszenzkorrelationspektroskopie (FCS) und
Photobleaching (CP). Das Diffusions- und Bindungsverhalten
verschiedener fluoreszenzmarkierter Makromoleküle wurde
mit FCS und CP analysiert und mit einer neuen Theorie
beschrieben [14]. Damit konnte z.B. die mittlere Aufenthaltsdauer
von Transkriptionsfaktoren an Bindungsstellen
im Zellkern bestimmt werden und ein Verfahren entwikkelt
werden, um die absolute Chromatindichte in Interphasezellkernen
zu messen [19]. In dieser Studie konnten wir
zeigen, dass der Volumenanteil der Chromatinfiber z.B. in
HeLa-Zellen nur etwa 10% ausmacht und dass alle Bereiche
des Zellkerns für kleinere Proteinmoleküle zugänglich
sind. Letzteres wurde auch durch neuere Messungen bestätigt,
bei denen das Diffusionsverhalten eines rot fluoreszierenden
Proteins mit der Chromatindichte korreliert wurde.
Es zeigte sich keine Abhängigkeit der Mobilität von der
Chromatindichte (Dross und Langowski, unveröffentlicht).
In vivo-Charakterisierung von Protein-Protein-
Wechselwirkungen im AP-1-System mit
Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie
N. Baudendistel, G. Müller, W. Waldeck, J. Langowski
In Zusammenarbeit mit Peter Angel (DKFZ)
Das AP-1-System besteht aus einer Gruppe von TPA-
(Tetradecanoylphorbolacetat) induzierbaren Transkriptionsaktivatoren.
Die Hauptbestandteile sind c-Jun und c-Fos,
beides Proteine mit einer für die Dimerisierung zuständigen
Leucin-Zipper-Region. C-Jun bildet sowohl Heterodimere
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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