MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt E
Innovative Krebsdiagnostik und -therapie
5. In vitro Modell der Pankreaskarzinogenese:
Detektion von Genen, die differentiell
während der schrittweisen Karzinogenese in
bovinen Pankreasgangzellen exprimiert
werden.
R. Jesenofsky, R. Faissner
In Zusammenarbeit mit Dr. Jörg Hoheisel und Dr. Dimitrij
Zoubakov (DKFZ B070)
In diesem Projekt wurde der Effekt definierter singulärer
Gendefekte in dem von uns entwickelten Modell der isolierten
bovinen Pankreasgangepithelzellen am Beispiel eines
mutierten ras Onkogens untersucht. Im Zentrum stand dabei
die Frage, welche Gene - vermittelt durch Expression
des mutierten ras Onkogens - neuexprimiert bzw. angeschaltet
oder herunterreguliert werden und somit zur Karzinogenese
beitragen können.
Die Identifizierung der differentiell exprimierten Gene erfolgte
mittels der SSH (Suppression Subtractive Hybridisation),
die im Gegensatz zur RDA oder DDRT-PCR bereits nach
einer Selektionsrunde auch „low abundant“ cDNAs amplifizieren
kann. Mittels dieser Technik wurden bisher 49 differentiell
exprimierte Gene identifiziert (21 herauf-, 28 herunterreguliert
in den k-ras transfizierten Zellen). Die differentielle
Genexpression wurde mittels Hybridisierung auf einem
cDNA Array überprüft, einzelne der Gene wurden mittels
semiquantitativer RT-PCR nochmals unabhängig verifiziert.
Um sicherzustellen, daß die differentielle Genexpression
letztendlich in einer biologisch relevanten unterschiedlichen
Expression von Proteinen mündet, untersuchten wir parallel
die gesamte Proteinexpression (Proteomics) der beiden
Zellklone. Dazu wurden Zellextrakte der beiden Zellinien
nach Optimierung der Aufarbeitung mittels 2D-Gelektrophorese
analysiert. Differentiell exprimierte Proteine wurden
gepickt und nach Gelverdau mittels Massenspektrometrie
analysiert. Mittels dieser Methode konnten wir bislang 37
differentiell exprimierte Proteine identifizieren. Dabei ergaben
sich nur geringe Korrelationen der RNA- und Proteindaten,
was für ähnliche Untersuchungen bereits in der Literatur
beschrieben wurde. Mit beiden Methoden konnten
aber Gene bzw. Proteine identifiziert werden, deren differentielle
Expression beim Pankreaskarzinom schon publiziert
worden sind. Diese Techniken sollten deshalb nicht als konkurrierend
sondern als sich ergänzend eingesetzt werden.
Desweiteren kann man durch die Identifizierung dieser Gene
und Proteine daraus schließen, dass unser in vitro Modell
die in vivo Situation gut widerspiegelt.
6. Immortalisierung humaner Pankreatischer
Sternzellen
R. Jesenofsky, D. Fürst
Die Desmoplasie ist ein Charakteristikum des Pankreaskarzinoms.
Bis zum heutigen Tag sind die molekularen Mechanismen
und die Zell-Zell-Interaktionen, welche zu dieser Fibrosierung
führen nicht aufgeklärt. Vor kurzem wurden pankreatische
Stern-Zellen (PSC) isoliert und charakterisiert.
Sie ähneln sowohl morphologisch als auch von der Expression
von Markerproteinen den Sternzellen der Leber, welche
eine zentrale Rolle bei der Leberfibrose einnehmen. Diese
pankreatischen Sternzellen scheinen für die Entstehung
der Pankreasfibrose (Desmoplasie) verantwortlich zu sein.
Da humane Sternzellen nicht maligne entartet sind, haben
sie nur eine finite Lebensspanne und müssen so immer
wieder frisch aus humanem Pankreasgewebe isoliert wer-
Klinische Kooperationseinheit E180
Gastroenterologische Onkologie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
den, was einen Vergleich von Resultaten erschwert. Die
Etablierung einer permanenten humanen Sternzellinie würde
deshalb die Untersuchungen der Pathomechanismen,
die der Fibrosierung bei der chronischen Pankreatitis zugrundeliegen,
erheblich vereinfachen. Aus diesem Grund
versuchen wir im Rahmen dieses Projektes eine immortale
humane Pankreassternzellinie zu etablieren. Dies ist uns gelungen,
womit wir ein zellbiologisches Werkzeug zur Aufklärung
der molekularen Pathomechanismen der Pankreasfibrose
in der Hand haben.
7. TGF1 Signalwege in der SMAD4 deletierten
Tumorzellinie BxPC-3
R. Jesenofsky, B. Sander
In Zusammenarbeit mit Dr. G. Molema, Univ. Gronignen,
Niederlande, Prof. H. Kalthoff, Univ. Kiel und Prof. S.A. Hahn,
Ruhr-Univ. Bochum.
Der Transforming Growth Factorβ1 (TGFβ1) ist ein potenter
Wachstumsinhibitor für normale epitheliale Zellen. Die meisten
Tumorzellinien sind resistent gegenüber dieser TGFβ1induzierten
Wachstumsinhibierung, was darauf hindeutet,
daß TGFβ1 eine wichtige Rolle bei der Genese dieser Tumoren
spielt. TGFβ1 entfaltet seine Wirkung mittels einer Signalkaskade
über die TGFβ1-Rezeptoren, SMAD-Proteine
und Coaktivatoren. Dabei kommt es nach einer Aktivierung
der Rezeptor-SMADs SMAD 2/3 zu einer Assoziation mit
SMAD4 und dieser Komplex translociert daraufhin in den
Nukleus der Zelle, wo eine Transkription der Zielgene induziert
oder reprimiert wird. Verschiedene Tumorzellinien, denen
notwendige Bestandteile dieses Signalweges fehlen,
wie z.B. die TGFβ1-Rezeptoren oder SMAD4, sind dennoch
TGFβ1-sensitiv. Deshalb ist ein von der klassischen TGFβ1-
Signalkaskade unabhängiger Signaltransduktionsweg notwendig.
Wir konnten für die SMAD4 deletierte Pankreastumorzellinie
BxPC-3 zeigen, daß Stimulation mit TGFβ1 zu
einer Akkumulation von SMAD3 im Nukleus der Zellen führt.
Weiterhin resultierte diese Stimulation in einer Induktion
der Expression einer vielzahl von Genen wie Wachstumsfaktoren,
Zellzyklus- und ECM-Proteinen, z.B. von CTGF, WAF1,
Fibronektin und Collagen type I. Dabei wurden die TGFβ1-
Signale über den Ras/MAPK bzw. JNK-Signalweg übertragen,
da eine Praeinkubation der Zellen mit spezifischen
Inhibitoren die TGFb1-Induktion verhindert.
8. Chemoresistenz solider Tumore
R. Faissner, J. Ringel, F.M. Hummel, R. Jesenofsky,
T. Metzger, K. Lang
In Kooperation mit Dr. M. Schnölzer (DKFZ), Dr. J. Hoheisel (DKFZ
B070), Prof. D. Schadendorf (DKFZ D070), Dr. R. Eils (B080).
Die Unempfindlichkeit gegenüber praktisch allen gängigen
Zytstatika ist eines der Hindernisse, weswegen die Prognose
des Pankreaskarzinoms so schlecht ist. Wir haben im Rahmen
eines Verbundprojektes begonnen, mittels der Kombination
von Tanscriptomics und Proteomics in in vitro-Modellen die
Mechanismen auf Tumorzellebene zu untersuchen. Dazu
werden RNA und Proteingemische aus sorgsam ausgewählten
Zelllinien (Capan-1, Paca-44 und Panc-1), die mit unterschiedlichen
Zytostatika behandelt wurden, mittels hochauflösender
2D-Gelelektrophorese und Mikro-Array-Chips
analysiert.