MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Analyse funktioneller Konsequenzen von
Sequenzvariationen in den Genen SLC21A6 und
SLC21A8, die für die hepatozellulären
Aufnahmetransporter OATP2 (OATP1B1) und
OATP8 (OATP1B3) kodieren
C. Michalski, K. Letschert, Y. Cui, A.T. Nies, D. Keppler,
J. König
In Zusammenarbeit mit: M. Eichelbaum, U. Zanger, Institut für
Klinische Pharmakologie, Robert-Bosch-Krankenhaus, Stuttgart,
P. Neuhaus und A. Nüssler, Chirurgische Universitätsklinik
Charité, Berlin
Die humanen Transporter SLC21A6 (auch bezeichnet als
OATP2, OATP1B1 oder OATP-C) und SLC21A8 (OATP1B3
oder OATP8) sind in der basolateralen Membran lokalisiert
und sind verantwortlich für die Aufnahme organischer Anionen
aus dem Blut in die Hepatozyten. Substrate für diese
Transporter sind neben konjugiertem und unkonjugiertem
Bilirubin auch Gallensäuren und verschiedene Arzneimittel
wie Pravastatin, ein Hemmstoff der Cholesterol-
Biosynthese und Enalapril, ein ACE-Hemmer. In diesen Untersuchungen
sollten die Auswirkungen von häufigen
Sequenzvariationen, sogenannten Polymorphismen, und
von Mutationen in den Genen dieser Transporter auf die
Lokalisation und die Transporteigenschaften der mutierten
Proteine analysiert werden [9].
Durch die Untersuchung von 81 humanen Leberproben
mittels Immunblot konnte eine Leberprobe identifiziert
werden, die eine deutliche Reduktion der Menge des
SLC21A6-Proteins, verglichen mit den anderen untersuchten
Leberproben, zeigte. Bei der Analyse der SLC21A6mRNA
dieser Leberprobe konnte ein Haplotyp des
SLC21A6-Gens identifiziert werden, der im Vergleich zum
Wildtyp-Allel 5 Basenaustausche zeigte, 3 davon führten
nach der Translation zu Änderungen der Aminosäuresequenz.
Diese 3 Mutationen im SLC21A6-Gen wurden
in der SLC21A6-cDNA nachgestellt und die funktionel-
Abteilung A090
Tumorbiochemie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
len Konsequenzen dieser Austausche auf die Lokalisation
und die Transporteigenschaften des mutierten Proteins
untersucht. Zusätzlich wurde eine weitere SLC21A6-cDNA
konstruiert, die alle 5 Basenaustausche enthielt und somit
dem Haplotyp des SLC21A6-Gens entsprach [9].
Die Analyse der Häufigkeiten der Aminosäureaustausche
ergab, daß es sich bei den beiden Austauschen SLC21A6-
N130D und SLC21A6-P155T um häufige Polymorphismen
handelt. Beide Austausche befinden sich in der vorhergesagten
zweiten extrazellulären Schleife des SLC21A6-Proteins.
Der Austausch SLC21A6-L193R konnte nur in einer
Probe nachgewiesen werden, es handelt sich demnach
um die erste identifizierte, natürlich vorkommende Mutation
im SLC21A6-Gen. Beide SLC21A6-Proteine, welche die
Polymorphismen tragen, lokalisierten nach stabiler
heterologer Expression in MDCKII-Zellen vergleichbar dem
Wildtyp-Protein in der lateralen Membran, wohingegen die
größte Menge des mutationstragenden Proteins SLC21A6-
L193R intrazellulär lokalisiert wurde. Auch das dem
Haplotypen entsprechende Protein SLC21A6-M5 mit allen
3 Aminosäurenaustauschen konnte nur intrazellulär und
nicht in der lateralen Membran nachgewiesen werden. Die
Analyse der Transportfunktion der verschiedenen SLC21A6-
Proteine wurde ebenfalls mit den stabil transfizierten
MDCKII-Zellen durchgeführt. Beide mutationstragenden
Proteine SLC21A6-L193R und SLC21A6-M5 zeigten keinen
Transport der untersuchten Substrate Bromosulfophthalein,
17β-Glukuronosyl-estradiol und von der Gallensäure
Cholyltaurin. Zusätzlich konnte für den Polymorphismus
SLC21A6-P155T kein Transport von Cholyltaurin nachgewiesen
werden, die Transportrate für Cholyltaurin war beim
Polymorphismus SLC21A6-N130D im Vergleich zum
SLC21A6-Protein reduziert. Diese Untersuchungen zeigen,
dass die 2. extrazelluläre Schleife des SLC21A6-Proteins, in
der beide häufigen Polymorphismen lokalisiert sind, an der
Substraterkennung beteiligt zu sein scheint.
Vektorieller Transport von Substanzen durch Aufnahmetransporter (OATP8) und eine apikale Exportpumpe (MRP2) in kultivierten
MDCK-Zellen.
Apical
Tight junction
MDCK-Control
Basolateral
MDCK-MRP2
Transwell membrane
MRP2
OATP8
MRP2
MDCK-OATP8
MDCK-MRP2/
OATP8
OATP8