MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
onkosuppressiven Eigenschaften in das Kulturmedium, das
hemmend auf das Wachstum von Melanom- und Hepatomzellen
wirkt, das Wachstum von Fibroblasten hingegen
fördert. Die Analyse von in Melanomzellen integrierter AAV-2
DNA zeigte in Southernblots Restriktionsfragmente, die mit
einer Integration weniger (möglicherweise nur 2) Kopf-
Schwanz-verknüpfter viraler DNA Moleküle vereinbar ist.
Das Restriktionsmuster wird unter Bedingungen der Einzelzellklonierung
verändert. Die Analyse der AAV-2 DNA
aus Melanomzellklonen zeigte in keinem Fall mehr das Ausgangsmuster.
Stattdessen fand sich für jeden Klon ein individuelles
Muster.
Unsere Arbeiten befassen sich mit dem Mechanismus der
Wachstumsbeeinflußung von Zellen maligner Tumoren
durch AAV, mit der Charakterisierung des sezernierten Peptids,
mit der Analyse der Integrationsstelle von AAV-2 DNA
und der Stabilität der Integration. Im Zusammenhang mit
den Vektoreigenschaften von AAV beschäftigen wir uns
mit der Aufnahme von Wildtyp (wt Serotyp 5; AAV-5) und
rekombinanten AAVs in verschiedenen Zelltypen [1; 2].
Für HeLa Zellen konnten wir zeigen, daß AAV-5 wt einen
unüblichen Weg nimmt und im Golgi Bereich akkumuliert
[2]. Die Aufnahme von AAV-5 in andere Zelltypen, vor allem
in humane embryonale Fibroblasten, deren Wachstum
durch die Infektion mit AAV reversibel gehemmt wird, ist
Gegenstand unserer derzeitigen Arbeiten.
Desweiteren haben wir im Rahmen einer Kooperation über
Fragen der Replikation amphotroper Leukämierviren in normalen
humanen Fibroblasten mitgewirkt [3]. Eine weitere
Kooperation befasste sich mit der molekularen Analyse möglicher
Tumorsuppressor Gene in Hautkrebs [4].
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] Yan, Z.*, Zak, R.*, Luxton, G.W.G.*, Ritchie, T.C.*, Bantel-
Schaal, U. und Engelhardt, J.F.* (2002). Ubiquitination of both
adeno-associated virus type 2 and 5 capsid proteins affects the
transduction efficiency of recombinant vectors. J.Virol. 76: 2043-
2053.
[2] Bantel-Schaal, U., Hub, B. und Kartenbeck, J. (2002). Endocytosis
of adeno-associated virus type 5 leads to accumulation
of virus particles in the Golgi compartment. J.Virol. 76: 2340-
2349.
[3] Reuss, F.U., Berdel, B., Heber, R., und Bantel-Schaal, U.
(2002). Replication of enhancer-deficient amphotropic murine
leukemia virus in human fibrosarcoma but not in primary human
fibroblasts. J.Med.Virol. 68: 278-284.
[4] Mollenhauer, J., Deichmann, M.*, Helmke, B.*, Müller, H.,
Kollender, G., Holsmkov, U.*, Ligtenberg, T.*, Krebs, I.,
Wiemann, S., Bantel-Schaal, U., Madsen, J.*, Bikker, F.*, Klauck,
S.M., Otto, H.F.*, Moldenhauer, G. und Poustka, A. (2003). Frequent
downregulation of DMBT1 and galectin-3 in epithelial skin
cancer. Int.J.Cancer 105: 149-157.
Die Azetylierung des HIV Transaktivators Tat
induziert einen Kofaktorwechsel während der
HIV Transkription
K. Bartscherer, A. Dörr, C. Hetzer-Egger, B. Fritzsching,
K. Kählcke, P. Kurz, M. Ott, A. Pedal, F. Schmitt,
B. Schwer, A. Speyerer
In Zusammenarbeit mit M. Schnölzer, Zentrale Proteinanalytik,
DKFZ; J. Kartenbeck, Abteilung für Zellbiologie, DKFZ;
P. Henklein, Abteilung f. Biochemie, Humboldt Universität, Berlin;
P. Cole, Johns Hopkins University, Baltimore, USA; E. Verdin,
Gladstone Institute of Virology and Immunology, UCSF, San Francisco,
USA; M.-M. Zhou, Mount Sinai School of Medicine, New
York, USA; V. Horejsi, Academy of the Sciences, Prag,
Tschechische Republik.
F040
Pathogenitätsmechanismen
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Der HIV-eigene Transaktivator Tat spielt eine entscheidende
Rolle in der Kontrolle der Virusreplikation. Tat bindet an die
RNS Struktur TAR und ermöglicht so die effiziente Elongation
der HIV Transkripte. Ergebnisse unserer früheren und
jüngeren Studien zeigten, daß Tat durch die Histonazetyltransferase
p300 an einem Lysin (K50) in der RNS-bindenden
Region azetyliert wird [1]. Um die Bedeutung der azetylierten
Tatform in der Zelle zu studieren, wurden monoklonale
und polyklonale Antiseren hergestellt, welche ausschließlich
die K50-azetylierte Tatform erkennen. Mikroinjektion
dieser Antikörper führten zu einem kompletten Verlust
der Tat-vermittelten HIV Transkription, was die Bedeutung
der K50-Azetylierung für die Tatfunktion hervorhebt [2].
Außerdem wurde gezeigt, daß azetyliertes Tat zwar an
TAR RNS, nicht aber an den Kofaktor CyclinT1 bindet. Wir
postulieren deshalb einen Kofaktorwechsel im zellulären Tatkomplex,
der durch die Azetylierung/Deazetylierung von
K50 reversibel kontrolliert wird. Tatsächlich bindet Tat an
den transkripitonellen Koaktivator PCAF. Die NMR Strukturanalyse
der Tat/PCAF Interaktion zeigte eine direkte Bindung
des azetylierten K50 in Tat mit der „Azetylbindungstasche“
der PCAF Bromodomäne und definierte weitere
kritische Interaktionspunkte zwischen Tat und PCAF [3].
Mutation dieser Residuen führte zum völligen Verlust der
Tat/PCAF Bindung und der Tat/PCAF Synergie in der Zelle
[4]. Damit wurde gezeigt, daß die Azetylierung von K50
eine neue Interaktionsoberfläche auf Tat generiert, welche
für die transkriptionelle Aktivität des viralen Transaktivators
wichtig ist.
Ein neues Interessensgebiet unserer Gruppe ist das Hepatitis
C Virus (HCV). Das HCV env Protein E2 bindet mit hoher
Affinität an das humane Tetraspanin CD81. Unsere ersten
Studien haben einen neuartigen Regulationsmechanismus
für die Expression von CD81 auf der Oberfläche von B und
T-Lymphozyten gezeigt. CD81 wird nach Zellaktivierung rapide
internalisiert und auf Minivesikeln, sogenannten Exosomen,
aus der Zelle ausgeschleußt [5]. Zirkulierende
CD81+ Exosome konnten im Blut von Probanden nachgewiesen
werden und könnten der Sezernierung und dem
Transport von HCV Partikeln im Blutstrom dienen.
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] Dormeyer, W., Dörr, A., Ott, M. und Schnölzer, M. (2003).
Acetylation of the HIV-1 Tat protein: an in vitro study. Anal.
Bioanal. Chem. 376: 994-1005.
[2] Kaehlcke, K., Dörr, A., Hetzer-Egger, C., Kiermer, V.*,
Henklein, P.*, Schnölzer, M., Loret, E.*, Cole, P.*, Verdin, E.*
und Ott, M. (2003). Acetylation of Tat defines a cyclinT1-independent
step in HIV transactivation. Mol Cell. 12: 167-176.
[3] Mujtaba, S.*, He, Y.*, Zeng, L.*, Farooq, A.*, Carlson,
J.E.*, Ott, M., Verdin, E.* und Zhou, M.M.* (2002). Structural
basis of lysine-acetylated HIV-1 Tat recognition by PCAF
bromodomain. Mol. Cell. 9: 575-586.
[4] Dörr, A., Kiermer, V.*, Pedal, A., Rackwitz, H.R., Henklein,
P.*, Schubert, U.*, Zhou, M.M.*, Verdin, E.* und Ott, M. (2002).
Transcriptional synergy between Tat and PCAF is dependent on
the binding of acetylated Tat to the PCAF bromodomain. EMBO.
J. 21: 2715-2723.
[5] Fritzsching, B., Schwer, B., Kartenbeck, J., Pedal, A., Horejsi,
V.* und Ott, M. (2002). Release and intercellular transfer of cell
surface CD81 via microparticles. J. Immunol. 169: 5531-5537.
[6] Schwer, B., North, B.J.*, Frye, R.A.*, Ott, M. und Verdin,
E.* (2002). The human silent information regulator (Sir)2 homologue
hSIRT3 is a mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide-dependent
deacetylase. J. Cell. Biol. 158: 647-657.