MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Sequenzvariationen wurden auch im Gen des zweiten
hepatozellulären Aufnahmetransporters der OATP-Familie,
dem SLC21A8-Gen, untersucht. Diese Variationen wurden
durch Datenbankanalysen identifiziert. Bei dieser Untersuchung
wurden 3 Polymorphismen und eine Mutation durch
gezielte Mutagenese der SLC21A8-cDNA nachgestellt und
die Konsequenzen dieser Sequenzvariationen auf Lokalisation
und Transporteigenschaften der mutierten Proteine
analysiert. Auch bei dieser Untersuchung konnten Auswirkungen
von in der Bevölkerung häufig vorkommenden
Sequenzvariationen auf Proteinlokalisation und Transportfunktion
festgestellt werden.
Diese Untersuchungen belegen, daß die detaillierte Analyse
von Sequenzvariationen in Genen,die für Transportproteine
kodieren, von großer Bedeutung für das Verständnis
interindividueller Unterschiede bei der hepatobiliären
Elimination endogener und exogener Substanzen ist. Unterschiede
in der Transportfunktion von Aufnahmetransporten
oder Exportpumpen können somit auch molekulare
Grundlagen von Arzneimittelnebenwirkungen sein [9].
Nachweis der humanen organischen
Anionentransporter SLC21A6 (OATP2) und
SLC21A8 (OATP8) in der Leber und im
hepatozellulären Karzinom
Y. Cui, J. König, A.T. Nies, M. Pfannschmidt, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: M. Hergt, W.W. Franke, Zellbiologie,
DKFZ (Monoklonale Antikörper) und R. Moll, Pathologisches
Institut, Universität Marburg (Immunhistochemie)
Die humanen hepatozellulären Aufnahmetransporter
SLC21A6 (OATP1B1 oder OATP2) und SLC21A8 (OATP
1B3 oder OATP8) sind wichtige Transportproteine bei der
hepatobiliären Elimination endogener und exogener Substanzen.
Zur immunologischen Detektion des SLC21A6-
Proteins wurden zwei monoklonale Antikörper hergestellt
und die Expression und Lokalisation von SLC21A6 in humaner
Leber und in hepatozellulären Karzinomen untersucht
[13]. Der Antikörper mESL ist gegen das carboxyterminale
Ende des Proteins, der Antikörper mMDQ gegen das
aminoterminale Ende des Proteins gerichtet. Da das
SLC21A6-Protein eine Aminosäuresequenz-Identität von
80 % mit dem SLC21A8-Protein hat, konnte mit dem
mMDQ-Antikörper auch das SLC21A8-Protein detektiert
werden, wohingegen der mESL-Antikörper als spezifisch
für das SLC21A6-Protein charakterisiert werden konnte.
Eine Detektion anderer humaner SLC21A-Familienmitglieder
oder entsprechende Transporter von Hund, Ratte oder
Maus konnte ausgeschlossen werden [13].
Die beiden Antikörper wurden auf ihre Reaktivität im
Immunblot, auf ihre Fähigkeit zur Immunpräzipitation und
auf ihre Eigenschaften bei der Immunfluoreszenz untersucht.
Im Immunblot können mit dem mMDQ-Antikörper
sowohl das SLC21A6-Protein als auch das SLC21A8-Protein
gleichzeitig detektiert werden, da der Antikörper das
aminoterminale Epitop beider Proteine aufgrund der sehr
ähnlichen Aminosäuresequenz erkennt, sich die beiden
Proteine im Molekulargewicht aber unterscheiden. Das
konnte durch eine Analyse von Proben aus normaler Leber
im Vergleich zu Proben aus hepatozellulären Karzinomen
belegt werden. Diese Immunblot-Analyse zeigte, daß im
hepatozellulären Karzinom das SLC21A8-Protein stark, das
SLC21A6-Protein deutlich im Vergleich zur Proteinmenge
in den Normal-Leberproben reduziert ist. Beide Proteine
konnten in der humanen Hepatom-Zelllinie HepG2 nicht
Abteilung A090
Tumorbiochemie
nachgewiesen werden. Ein interessanter Aspekt ist die Analyse
von Leberproben, die zuvor in Paraffin eingebettet
wurden. Bei diesen immunhistochemischen Analysen von
normalen Leberproben konnten sowohl das SLC21A6-Protein
als auch das SLC21A8-Protein nachgewiesen werden.
Im Gegensatz dazu ließen sich beide Proteine in Lebertumorproben
nur fokal nachweisen. Diese Analysen zeigen,
dass beide monoklonale Antikörper als Tumormarker
für den Nachweis beim hepatozellulären Karzinom Verwendung
finden können und dass diese Antikörper auch ein
geeignetes Werkzeug darstellen, beide wichtigen
Aufnahmetransportproteine unter physiologischen und
pathophysiologischen Bedingungen zu untersuchen [13].
Lokalisation von MRP5 (ABCC5) im
Urogenitalsystem des Menschen
A.T. Nies, G. Jedlitschky, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale
Laserrastermikroskopie) und W.F. Thon, Klinikum Hannover-
Siloah, Hannover
MRP5 (ABCC5) des Menschen ist eine ATP-abhängige,
membranständige Exportpumpe für die zyklischen Nukleotide
cGMP und cAMP, die durch Sildenafil und Trequinsin
wirksam gehemmt wird (Jedlitschky et al., J. Biol. Chem.
275: 23161-23168, 2000). Beide Substanzen sind als
Inhibitoren der cGMP-spezifischen Phosphodiesterase 5
(PDE5) bekannt. Wir haben untersucht, ob in denjenigen
Zellen des Urogenitalsystems des Menschen, die PDE5 synthetisieren,
auch MRP5 vorhanden ist. Wir konnten durch
Immunblot-Analyse zeigen, daß MRP5 in verschiedenen
Geweben des Urogenitalsystems (Harnleiter, Harnblase,
Harnröhre, Corpus cavernosum) synthetisiert wird [1]. Mit
einem MRP5-spezifischen, affinitätsgereinigten Antikörper
konnten wir MRP5 in der Zellmembran von glatten Muskelzellen
des Harnleiters, der Harnblase, der Harnröhre und
des Corpus cavernosum, sowie in der Zellmembran von
Urothelzellen des Harnleiters und der Harnröhre nachweisen
[1]. Die glatten Muskelzellen und die Zellen des Urothels
synthetisieren ebenfalls PDE5 [1]. Diese gleichzeitige Synthese
von MRP5 und PDE5 in beiden Zelltypen weist darauf
hin, daß intrazelluläre Signale, die durch cGMP ausgelöst
werden, nicht nur durch einen PDE5-vermittelten
cGMP-Abbau, sondern auch durch einen MRP5-vermittelten
cGMP-Export terminiert werden können.
Zelltyp-spezifische Verteilung von MRP-
Isoformen im Gehirn des Menschen
A.T. Nies, J. König, G. Jedlitschky, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: H.H. Steiner und C. Herold-Mende,
Neurochirurgische Universitätsklinik, Heidelberg, und H.P.
Schmitt, Neuropathologie, Universität Heidelberg
MRP-Isoformen sind Transportproteine in der Zellmembran,
welche den Export organischer Anionen aus Zellen vermitteln
[10, 17]. Verschiedene Zytostatika und antivirale Medikamente
zählen ebenfalls zu den MRP-Substraten. In der
Blut-Hirn-Schranke können MRP-Isoformen einerseits dazu
beitragen, das Gehirn vor toxischen Substanzen zu schützen;
andererseits wurde eine hohe intrinsische Resistenz
von Hirntumoren gegenüber Zytostatika beschrieben, die
zumindest teilweise auf die Existenz von MRP-Isoformen
zurückgeführt werden könnte. Außerdem sind MRP-
Isoformen wahrscheinlich für einige physiologische Funktionen
des Gehirns, wie dem Efflux von cGMP und cAMP,
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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