MDCK-MRP2 - Dkfz

56
Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
von Bedeutung. Unsere Untersuchungen zeigen erstmals
eine systematische Analyse der zelltyp-spezifischen Verteilung
von MRP1-MRP6 (ABCC1-ABCC6) im Gehirn des Menschen
(Nies et al., zur Publikation eingereicht). Durch immunfluoreszenz-mikroskopische
Untersuchungen mit
isoform-spezifischen Antikörpern lokalisierten wir MRP1,
MRP4 und MRP5 in der luminalen Membran von Epithelzellen
der Gehirnkapillaren. MRP4 und MRP5 waren auch in
Astrozyten vorhanden. In pyramidalen Neuronen war stets
MRP5 nachweisbar, in einigen Fällen auch MRP6. Die
Isoformen MRP2 und MRP3 waren im Gehirn nicht
detektierbar. Die im Gehirn nachgewiesenen MRP-Isoformen
können daher am Export anionischer Konjugate mit
Glutathion und Glucuronat (Substrate für MRP1 und MRP6),
am Export zyklischer Nukleotide (Substrate von MRP4 und
MRP5) und am Export von Glutathion (Ko-Substrat für MRP1
und MRP4) beteiligt sein.
Expression und Lokalisation von hepatozellulären
Transportproteinen und von Radixin bei
der primär-biliären Zirrhose des Menschen
H. Kojima, A. Nies, J. König, W. Hagmann, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale
Laserrastermikroskopie), und M. Uemura und H. Fukui, Nara
Medical University, Kashihara, Japan
Die primär-biliäre Zirrhose (PBC) ist eine chronische cholestatische
Lebererkrankung des Menschen, die durch eine
im Laufe der Jahre zunehmende Zerstörung der Gallengänge
charakterisiert ist. Die damit einhergehende chronische
Entzündung führt zu Vernarbungen in der Leber und
schließlich zu Zirrhose und Ikterus. Unser Interesse galt
der Analyse der molekularen Grundlagen der bei der PBC
auftretenden Cholestase und der gestörten hepatobiliären
Elimination von Substanzen. Wir haben die Expression und
Lokalisation verschiedener hepatozellulärer Membrantransportproteine
in Nadel-Leberbiopsien von Patienten in
frühen PBC-Stadien (I, II, III) untersucht, die eine
Cholestase, aber keinen Ikterus hatten [15]. Zu den untersuchten
Transportproteinen zählten die Aufnahmetransporter
für organische Anionen OATP2 (OATP1B1,
SLC21A6) und OATP8 (OATP1B3, SLC21A8), der natriumabhängige
Gallensalztransporter NTCP (SLC10A1) sowie die
ATP-abhängigen Exportpumpen MRP2 (ABCC2), MRP3
(ABCC3), MRP6 (ABCC6), MDR1-P-Glykoprotein (ABCB1),
MDR3-P-Glykoprotein (ABCB4) und die Gallensalz-Exportpumpe
BSEP (ABCB11) [15]. Außerdem untersuchten wir
die Expression und Lokalisation von Radixin, welches an
der Verankerung von Membranproteinen an Aktinfilamente
beteiligt ist. Durch den in Mäusen künstlich erzeugten Ausfall
von Radixin fehlt die Exportpumpe für Bilirubin-Konjugate,
das Mrp2, in der apikalen Membran der Hepatozyten, sodass
es zur konjugierten Hyperbilirubinämie in den Radixin-Knockout-Mäusen
kommt [7].
In Leberproben von Patienten mit PBC Stadium I und II
war die Expression und Lokalisation der hepatozellulären
Transportproteine im Vergleich zu Leberproben aus der
Kontrollgruppe unverändert [15]. Für die Leberproben von
Patienten mit PBC im Stadium III ergaben sich folgende
Veränderungen: 1. Semi-quantitative Immunfluoreszenzund
quantitative RT-PCR-Analysen zeigten eine Reduktion
der Expression und Synthese aller drei untersuchten
Aufnahmetransporter [15]. 2. Während MRP2 und Radixin
in der apikalen Membran von normalen Hepatozyten kolokalisierten,
war diese Ko-Lokalisation in einigen Bereichen
Abteilung A090
Tumorbiochemie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
der Leberproben von Patienten mit PBC Stadium III nicht
mehr zu beobachten [15]. In diesen Bereichen zeigte sich
eine diffuse und unregelmäßige Lokalisation von MRP2,
welche auf eine Umverteilung von MRP2 aus der apikalen
Membran in das Innere der Hepatozyten schließen ließ.
Diese Bereiche waren gleichzeitig durch eine starke Reduktion
in der Intensität der Radixin-Immunfluoreszenzfärbungen
charakterisiert [15]. Unsere Untersuchungen
zeigen, daß die verminderte Synthese von Aufnahmetransportern
zur gestörten hepatobiliären Elimination in PBC
Stadium III beitragen kann. Die teilweise veränderte Lokalisation
von MRP2 deutet möglicherweise den Übergang
von PBC Stadium III zum PBC-Endstadium an, das mit einem
Ikterus einhergeht.
Zellbiologische Charakterisierung von carboxyterminalen
Trunkierungskonstrukten der
apikalen Konjugat-Exportpumpe MRP2 (ABCC2)
A.T. Nies, J. König, Y. Cui, M. Brom, D. Keppler
In Zusammenarbeit mit: H. Spring, Zellbiologie, DKFZ (Konfokale
Laserrastermikroskopie)
Der Carboxyterminus einiger Membrantransportproteine
enthält ein Aminosäurenmotiv, welches an bestimmte intrazelluläre
Ankerproteine, die PDZ-Proteine, binden kann
und bei manchen Proteinen als apikales Sortierungssignal
benötigt wird. PDZ steht hierbei für den jeweils ersten
Buchstaben der Proteine Psd, Dgl und ZO-1-like; in diesen
drei Proteinen wurde eine konservierte Proteindomäne
identifiziert, die spezifisch an Tripeptide der Struktur S/T -
X - V/I bindet. Auch das MRP2-Protein enthält ein vergleichbares
carboxy-terminales Tripeptid (TKF), welches mit
dem Ankerprotein PDZK1 interagieren kann (Kocher et al.,
Lab. Invest. 79: 1161-1170, 1999). Wir haben verschiedene
cDNA-Konstrukte hergestellt, die zur Synthese von
carboxy-terminal trunkierten MRP2-Proteinen führen, welche
gleichzeitig am Aminoterminus mit dem grün-fluoreszierenden
Protein markiert sind [3]. Die Lokalisation dieser
trunkierten MRP2-Proteine wurde in polarisierten HepG2-
Hepatomzellen bestimmt, die sich gut für die Untersuchung
der apikalen Sortierung von humanem MRP2 eignen. Es
zeigte sich, daß die 11 carboxy-terminalen Aminosäuren
von MRP2, einschließlich des Tripeptids TKF, nicht für den
intrazellulären Transport von MRP2 zur apikalen Membran
erforderlich waren [3]. Erst eine Trunkierung um mindestens
15 carboxy-terminale Aminosäuren führte zu einer
Störung des intrazellulären Transports von MRP2 zur apikalen
Membran [3]. Es ist denkbar, daß ein apikales Sortierungssignal
nicht in der linearen Aminosäurensequenz
des MRP2-Proteins begründet liegt, da Membranproteine
auch diskrete, voneinander entfernt liegende Elemente
enthalten können, die erst im reifen Protein miteinander
in Wechselwirkung treten und dadurch die erforderliche
Struktur eines Sortierungssignals ergeben.