MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Protein-1 (NAP1) kodiert, auszuschalten (knockout). Dieses
Gen wurde kürzlich als potentiell mit p127l(2)gl interagierendes
Protein identifiziert. Es wird durch die Casein
Kinase II [7] phosphoryliert.
Eine weitere Zusammenarbeit wurde innerhalb des Netzwerkes
eines europäischen Projektes zur Konstruktion einer
neuen Drosophila Deletions- und Duplikationskollektion
(DrosDel-Projekt) etabliert. Es werden überlappende Deletionen
in der Größenordnung von 0,5 bis 1,0-Mb erzeugt,
welche das gesamte euchromatische Drosophila Genom in
einem isogenen background abdecken sollen. Ungefähr 260
Defiziensen decken ca. 60 % des Genoms ab. Unsere Kollektion
von Defiziensen schließt schätzungsweise mehr als
80 % des Drosophila Genoms ein. Eine erste Publikation,
welche das Transposonelement, das wir für die Erzeugung
der Defiziensen einsetzen, befindet sich im Druck [11].
5.1. Organisation des SmD3 und Ornithine
Decarboxylase Antizyme Gens
Das Drosophila Gen für snRNP Sm D3, oder SmD3, ist in
umgekehrter Orientierung in dem ersten Intron des Ornithine
Decarboxylase Antizyme (AZ) Gens lokalisiert. Frühere
Untersuchungen haben gezeigt, daß zwei benachbart
liegende P-Elemente den gutfeeling Phänotyp verursachen,
der durch embryonale Letalität und abnorme Differenzierung
der neuronalen Zellen und Muskelzellen charakterisiert
ist. Bisher ist die Natur der Gene, die durch den
gutfeeling Phänotyp betroffen sind, unbekannt. Unsere
Studien zeigen, daß P-Insertionen, die innerhalb der 5‘
“untranslated” Region (UTR) von SmD3 oder innerhalb des
Promotors liegen, nur die Expression von SmD3 beeinträchtigen.
Wir können zeigen, daß der gutfeeling Phänotyp,
der mit den P-Element-Insertionen in der 5’ UTR-Region
von SmD3 assoziiert ist, auf eine amorphe oder hypomorphe
Mutation zurückzuführen ist. Dagegen reduzieren P-Insertionen
in der SmD3 Promotorregion die Expression von
SmD3 und rufen larvale Letalität sowie “overgrowth” der
Imaginalscheiben, der Gehirnhemisphären und des
hematopoetischen Organs hervor. Die Letalität dieser Mutationen
konnte durch ein SmD3 + Transgen verhindert werden.
Die Inaktivierung von AZ trat auf, wenn wir die
Df(2R)guf lex47 Defiziens, bei welcher SmD3 und AZ partiell
deletiert sind, durch SmD3 + komplementierten. Dabei stellte
sich heraus, daß die AZ-Inaktivierung einen neuen Phänotyp
hervorbringt, der durch larvale Letalität und Atrophie
des Gehirns, der Imaginalscheiben, der hematopoetischen
Organe und der Speicheldrüsen gekennzeichnet ist [4].
5.2. Knockout targeting des Drosophila NAP1
Gens
Mittels ”ends-in gene targeting” erzeugten wir Knockout
Mutationen im nucleosome assembly protein 1 (Nap1) Gen.
Wir erhielten drei voneinander unabhängige Knockout
Mutationen. In Proteinextrakten von lebensfähigen adulten
“escapers” konnte kein Wildtyp NAP1 nachgewiesen werden.
Die Entwicklung homozygoter Nap1KO Tiere weist
polyphasische Letalität auf und kann zu einer geringen Anzahl
schwach lebensfähiger adulter “escapers” führen. Um
Informationen über die zugrunde liegenden molekularen
Vorgänge bei der homologen Rekombination zu erhalten,
erzeugten wir in den rekombinanten Produkten “conversion
tracts”. In fast allen Fällen wurde die Stelle des “donor
vectors” ersetzt durch die Nap1 Sequenz. Das weist auf
einen Prozess hin, der Exonucleaseaktivität an der Stelle
des Doppelstrangbruches (DSB) einschließt, gefolgt durch
replikative Reparatur der “donor-target junctions”. Die
“targeting” Produkte werden am besten entweder durch
Abteilung A040
Entwicklungsgenetik
das klassische DSB Reparaturmodell oder durch das “breakinduced”
Rekombinations (BIR)-Modell erklärt. Das von Synthese
abhängige “strand annealing” (SDSA), welches ein
weiterer wichtiger, bei Rekombinationsvorgängen stattfindender
Reparatur-pathway in der Keimbahn ist, konnte
nicht dazu herangezogen werden, um “ends-in targeting”
Produkte zu erklären. Wir schließen daraus, daß dieses Beispiel
für “Gen-targeting” am Nap1 Locus, eine weitere
Unterstützung für die Effizienz dieser Methode ist und für
ihre Anwendbarkeit zum “targeting” jedes beliebigen Locus
im Drosophila Genom spricht [7].
6. Weitere Beiträge
In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Christof Niehrs
haben wir Transgene erzeugt, die den Maus Kremen-2
Rezeptor und den Xenopus-Dickkopf-1 Ligand exprimieren,
um nachzuweisen, daß diese Proteine bei dem Wnt/ß-
Catenin ”signalling” eine Funktion ausüben [8]. In Zusammenarbeit
mit der Gruppe Frank Lyko haben wir die Expression
des dMBD2/3 methyl-DNA binding Proteins im
Verlauf der embryonalen Entwicklung und seine Stadienspezifische
chromosomale Assoziation zum Zeitpunkt der
Genomaktivierung, untersucht [9]. Schließlich haben wir
zur Charakterisierung der cytosolischen Malatdehydrogenase
und zu den Untersuchungen über ihre Regulation durch
Juvenilhormon während der larvalen und pupalen Entwicklung
von Drosophila beigetragen [10].
Publications (* = externer Koautor)
[1] *Kuchárová-Mahmood, S.,* Raska, I., Mechler, B. M., and
*Farkas, R. (2002) Temporal regulation of Drosophila salivary
gland degeneration by the Broad-Complex transcription factors.
J. Struct. Biol. 140: 67-78.
[2] Li., Marhold, J., Gatos, A., Török, I., and Mechler, B. M.
(2001). Differential expression of two Scribble isoforms during
Drosophila embryogenesis. Mech. Dev. 108: 185-190.
[3] Marhold, J., Papagiannouli, F., Li, M., *Patel, A., and Mechler,
B. M. (2003) Requirements for scribble expression in newly
formed gonads of Drosophila embryos. Gene Expression Patterns
3:143-146.
[4] Schenkel, H., Hanke, S., De Lorenzo, C., Schmitt, R., and
Mechler B. M. (2002) P-elements inserted in the vicinity or within
the Drosophila snRNP SmD3 gene nested in the first intron of the
Ornithine Decarboxylase Antizyme gene affect only the expression
of SmD3. Genetics 161: 763-772.
[5] *Gorjánácz, M., *Adam, G., Török, I., Mechler, B. M.,
*Szlanka, T., and *Kiss, I. (2002) Importin-α2 is critically required
for the assembly of ring canals during Drosophila oogenesis. Dev.
Biol. 251: 271-282.
[6] Giarrè, M., Török, I., Schmitt, R., *Gorjánácz, M., *Kiss, I.,
and Mechler, B. M. (2002) Patterns of importin-α expression during
Drosophila spermatogenesis. J. Struct. Biol. 140: 67-78.
[7] Lankenau, S., Barnickel, T., Marhold, J., Lyko, F., Mechler, B.
M., and Lankenau, D.-H. (2003) Knockout targeting of the Drosophila
Nap1 gene and examination of DNA repair tracts in the recombination
products. Genetics 163: 611-623.
[8] Mao, B., Wu, W., Davidson, G., Marhold, J., Li, M., Mechler,
B. M., Delius, H., Hoppe, D., Stannek, P., Walter, C., Glinka, A.,
and Niehrs, C. (2002). Kremen proteins are Dickkopf receptors
that regulate Wnt/ß-catenin signaling. Nature 417: 664-667.
[9] Marhold, J., Zbylut, M., Lankenau, D.-H., Li, M., *Gerlich,
D.,*Ballestar, E., Mechler, B. M., and Lyko, F. (2002) Stage-specific
chromosomal association of Drosophila dMBD2/3 during genome
activation. Chromosoma 111: 13-21.
[10] *Farkas, R., *Danis, P.,* Medved’ová, L., Mechler, B. M.,
and *Knopp, J (2002) Regulation of cytosolic malate dehydrogenase
by juvenile hormone in Drosophila melanogaster. Cell
Biochem. Biophys. 37: 37-52.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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