MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt E
Innovative Krebsdiagnostik und -therapie
Pharmakologie der Krebsbehandlung (E120)
Leiter: Prof. Dr. med. W. Jens Zeller
Wissenschaftler
Dr. Stephanie Laufs Dr. Rüdiger Port
Dr. Renate Port Dr. Marlon Veldwijk
Studenten/Doktoranden
cand.med. Simone Berlinghoff cand. med. Fara Bozorgmehr
cand.med. Falk Dillmann cand.med. Frank Giordano
cand.med. Marius Stiefelhagen cand.med. Moritz Schad
Dipl.biol. Zsuzsanna Nagy cand.med. Aleksandar Radujkovic
cand.med. Daniel Ribeiro cand.med. Timon Seeger
Technische Assistenten
Bernhard Berkus Hans-Jürgen Engel
Sigrid Heil (½)
Sekretärin
Brigitte Pétillion (1/3)
Integrationsanalyse von retroviralen Vektoren
in hämatopoetischen Stammzellen
S. Laufs, K.Z. Nagy, F. Giordano, S. Fruehauf*,
W.J. Zeller
* Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg
Mit Hilfe der Insertionsmutagenese durch das murine Leukämievirus
konnte eine Vielzahl für die Krebsentstehung
relevanter Wirtsgene identifiziert werden. Während so die
Insertionsmutagenese von retroviralen Vektoren wesentliche
Erkenntnisse über die Krebsentstehung ermöglicht hat,
stellt sie andererseits bei den Ansätzen, die Viren als Vektoren
für die medizinische Anwendung einsetzen möchten
(Gentherapie), ein ernsthaftes Problem dar. Zwei Studien
haben verdeutlicht, dass das Risiko der Insertionsmutagenese
beträchtlich sein kann. So zeigten retroviral transduzierte
hämatopoetische Zellen in einem Mausmodell der
Knochenmarktransplantation erstmals das Potential der Vektorinsertionsmutagenese
bei der Leukämieinduktion. Im
leukämischen Klon fand sich die Aktivierung des Protoonkogens
evi-1 infolge der Insertion einer einzigen Kopie des
retroviralen Vektors. Nur wenige Monate nach dieser Publikation
wurden zwei Fälle leukämischer Komplikationen in
einer klinischen Gentherapiestudie für eine schwere kombinierte
Immundefizienz (X-SCID) nach retroviraler Modifikation
von Knochenmarkstammzellen bekannt. Auch hier
spielte die Aktivierung eines zellulären Onkogens (LMO2)
nach Insertion des retroviralen Vektors eine entscheidende
Rolle. In beiden Fällen, sowohl im Mausmodel als auch
bei den X-SCID-Patienten, führte die virale Integration zur
transkriptionellen Aktivierung eines Protoonkogens.
Von uns wurden humane periphere Blutvorläuferzellen mit
dem neuen retroviralen SF91m3-Vektor, der das humane
MDR1-Gen enthält, transduziert und anschließend in NOD/
SCID-Mäuse transplantiert. Anschließend wurde von uns
auf Basis der ligationsmediierten PCR (LM-PCR) eine Methode
entwickelt und optimiert, die es ermöglicht, gleichzeitig
mehrere Integrationsstellen von transduzierten gemischten
Zellpopulationen wie chimäres Mausknochenmark,
das transduzierte menschliche Stammzellen enthält, zu
untersuchen [1-3].
Weiterhin wurde von uns für klonale Zellpopulationen eine
Methode (PCR mit arbiträren Primern) zur Insertionsanalyse
in peripheren Blutstammzellen entwickelt. Beide Methoden
konnten zum ersten Mal mittels 24-Farben-FISH validiert
werden [3].
E120
Pharmakologie der Krebsbehandlung
Neueste Untersuchungen unserer Gruppe zeigen, dass das
Integrationsverhalten von Onkoretroviren und Lentiviren
in humanen peripheren Blutvorläuferzellen keinesfalls wie
bisher angenommen, zufällig ist. Es konnte eine vermehrte
Integration von Onkoretroviren in den Chromosomen
17 und 19 gezeigt werden [3].
Für onkoretroviral transduzierte menschliche Blutstammzellen
mit Langzeit-Repopulationspotential in immundefizienten
Mäusen konnten wir erstmals eine bevorzugte
Vektorintegration im ersten Intron von Genen identifizieren.
Publikationen (* = externer Koautor)
[1] *Fruehauf S, Veldwijk MR, Zeller WJ, Laufs S. Prospects and
RISC score of viral gene therapy for sarcoma. Expert Opin Biol
Ther. 2003 Dec;3(8):1241-51.
[2] Gentner B, Laufs S, Nagy KZ, Zeller WJ, *Fruehauf S. Rapid
detection of retroviral vector integration sites in colony-forming
human peripheral blood progenitor cells using PCR with arbitrary
primers. Gene Ther. 2003 May;10(9):789-94.
[3] Laufs S, Gentner B, Nagy KZ, *Jauch A, Benner A,
*Naundorf S, *Kuehlcke K, *Schiedlmeier B, *Ho AD, Zeller WJ,
*Fruehauf S. Retroviral vector integration occurs in preferred
genomic targets of human bone marrow-repopulating cells.
Blood. 2003 Mar 15;101(6):2191-8. Epub 2002 Nov 07.
Rekombinante Adeno-assoziiertes-Virus-2-Suizidvektoren
für die Behandlung von Sarkomen
und Mesotheliomen
M.R. Veldwijk, S. Berlinghoff, S. Laufs, F. Wenz*,
S. Fruehauf** und W.J. Zeller
*Department of Radiation Oncology, Universitätsklinikum
Mannheim, Universität Heidelberg
** Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg
Trotz Fortschritten in der konventionellen Therapie von
Sarkomen und malignen Mesotheliomen ist die Behandlung
dieser Tumorentitäten insbesondere in fortgeschrittenen
Stadien unverändert eine große Herausforderung
und die Prognose ist bei einem hohen Prozentsatz dieser
Patienten schlecht. Auf der Suche nach neuen Behandlungsmöglichkeiten
stellen virale Suizidvektoren einen vielversprechenden
neuen Ansatz dar [1-3].
In vorangegangenen Untersuchungen beobachteten wir
die höchste Suszeptibilität bei Bindegewebssarkomzellen
(HS-1) für den rekombinanten adeno-assoziierten-Virus-2
(rAAV-2)-Vektor [Veldwijk et al., Eur J Cancer 35 (1999):
1136-1142; Veldwijk et al. Cancer Gene Ther 7 (2000):
597-604]. Jetzt wurden diese Ergebnisse an fünf weiteren
menschlichen Sarkomzelllinien bestätigt: Fibrosarkom
(HT-1080), Ewing Sarkom (RD-ES), Askin Tumor (SK-N-
MC), Rhabdomyosarkom (A-204) und Weichteilsarkom
(WSKL-1) [4]. Darüber hinaus zeigte sich, dass rAAV-2 sowohl
hohe Transduktionsraten als auch eine hohe GFP-
Expression in menschlichen Mesotheliomzelllinien (H-Meso-
1, MSTO-211H and NCI-H-28) erreicht [5, 6]. Aus rAAV-2-
Konstrukten, die verschiedene Promotoren enthalten, zeigte
der EF-1 alpha (Elongations-Faktor-1 alpha) enthaltende
Vektor nach Transduktion die höchsten Expressionsraten
sowohl in Sarkom- als auch in Mesotheliomzelllinien
[4, 5]. Um eine konstante Anzahl von Vektorpartikeln sicherzustellen,
wurden die stocks zum einen mittels funktionaler
Titrierung, zum anderen mit einer von uns etablierten,
auf real-time PCR-basierenden Methode titriert [7].
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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