MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
auf molekularer Ebene werden durch einen Vergleich mit
den Röntgenstrukturdaten analysiert.
Abb. 3: SFM-Aufnahme eines Filaments von menschlichem
Vimentin in Puffer.
Um die Assemblierung von Vimentin für Zeiten < 1s und
die darauf folgende Elongation der Filamente kinetisch zu
charakterisieren, wurden erste Messungen im Stopped-
Flow-System unserer Abteilung durchgeführt (Abb. 4). Aus
dem Zeitverlauf des Streulichtsignals, das dem Molekulargewicht
in erster Näherung proportional ist, konnten die
schnelle Bildung der Präassemblykomplexe im Sekundenbereich
und die langsamere Elongation unterschieden werden.
Die bisher durchgeführten Versuche im Stopped-Flow-Gerät
zeigten, dass die Assemblierung zeitlich aufgelöst beobachtet
werden kann. Einsatz verschiedener Konzentrationen
zeigt eine klare Konzentrationsabhängigkeit der Assemblierungsgeschwindigkeit
(blaue und rote Kurven), durch eine
systematische Analyse der Kinetik in Abhängigkeit von der
Konzentration und Pufferbedingungen, in Zusammenhang
mit statischen Lichtstreuungsmessungen, soll ein detailliertes
Model für den Assemblierungsmechanismus aufgestellt werden.
Abb. 4: Stopped-Flow Messung von zwei verschiedenen Vimentin
Konzentrationen. Der Kurvenverlauf zeigt, dass die Kinetik der
Assemblierung mit der Stopped-Flow Technik aufgelöst werden
kann; sie verläuft im Zeitbereich von 0.1-20 Sekunden.
Abteilung B040
Biophysik der Makromoleküle
Selektive Strukturänderungen in
Bacteriophagen durch Porphyrinderivate
K. Tóth
In Zusammenarbeit mit Gabriella Csík und Marianna Egyeki,
Semmelweis-Universität, Budapest, Ungarn
Porphyrinderivate finden weite Anwendung in der photodynamischen
Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten,
sowie bei der Desinfektion von Flüssigkeiten, allerdings
sind weder der molekulare Wirkungsmechanismus
noch die Zielmoleküle gut genug bekannt. Wir haben den
Bakteriophagen T7 als Modellsystem verwendet, um die
durch verschiedene Porphyrinderivate ausgelösten Strukturänderungen
an einem Nukleoproteinkomplex bei der Photoreaktion
und im Dunkeln zu untersuchen [21,22]. Die Bindung
der Porphyrine an T7 und DNA wurde durch Absorptions-
und Fluoreszenzspektroskopie (konventionell sowie
zeitlich aufgelöst) verfolgt. Strukturänderungen im Nukleoproteinkomplex
wurden durch thermische Denaturierung,
DNA-Läsionen durch PCR charakterisiert. Die optischen Signale
symmetrisch substituierter Tetraphenylporphyrine
zeigten in Gegenwart von T7 oder DNA keine Änderung.
Asymmetrisch substituierte Moleküle binden im Dunkeln an
T7, aber nicht an freie DNA, wie die Fluoreszenzmessungen
zeigen. Für die kationischen Derivate sind die spektralen
Veränderungen in Gegenwart von T7 oder DNA ähnlich.
Die Photoreaktion der drei untersuchten Meso-Tetraphenylporphyrine
zeigt sich durch Schädigung des viralen Kapsids,
ohne nachweisbare Veränderungen der DNA-Struktur.
Andererseits destabilisieren die kationischen Porphyrine die
DNA-Helix. Die Veränderungen in den verschiedenen Denaturierungsparametern
korrelieren gut mit den Ergebnissen
der PCR-Analyse und der Phageninaktivierungsrate. Die
Dunkelreaktion mit neutralen Phenylporphyrinen hat keinen
Effekt auf die thermische Stabilität der Phagen, und zeigt
keine nachweisbaren DNA-Läsionen in der PCR-Analyse.
Tetramethyl-4-pyridylporphyrin führt schon im Dunkeln zu
Destabilisierung der DNA (Gábor et al. 2001, Photochemistry
and Photobiology 73(3):304-307).
Die Komplexbildung von Tetrakis(4-N-methylpyridyl)porphyrin
(TMPyP) mit freier und capsidgebundener T7-Phagen-DNA
wurde durch spektrale Dekomposition, Fluoreszenzlebensdauer
und Zirkulardichroismusmessungen im
Detail studiert. Externe und interkalative Bindung an die
DNA konnten quantitativ unterschieden werden. Aus den
Messungen konnte gefolgert werden, dass die Bindung
von TMPyP die Struktur der Capsidproteine oder ihre Wechselwirkung
mit DNA nicht beeinflusst (Zupán, Herényi, Tóth,
Majer, Csík, in Vorbereitung).
Publikationen ( * = externer Koautor)
[1] F. Lankas, T. E. Cheatham III*, N. Spackova*, P. Hobza*, J.
Langowski, J. Sponer*: Critical effect of the N2 amino group on
structure, dynamics and elasticity of DNA polypurine tracts.
(2002) Biophys. J. 82, 2592-2609
[2] G. Wedemann, J. Langowski: Computer simulation of the 30nm
chromatin fiber. (2002) Biophys. J. 82(6), 2847-59.
[3] K. Klenin, J. Langowski, A. Vologodskii*: Computational
Analysis of the Chiral Action of Type II DNA Topoisomerases.
(2002) J. Mol. Biol. 320(2), 359-367.
[4] T. Weidemann, M. Wachsmuth, M. Tewes*, K. Rippe, J.
Langowski: Analysis of Ligand Binding by Two-Color Fluorescence
Cross-Correlation Spectroscopy. (2002) Single Molecules 3, 49-
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[5] M. Bussiek, K. Klenin, J. Langowski: Kinetics of site-site interaction
in superhelical DNA. (2002) J. Mol. Biol. 322(4), 707-18
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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