MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
B. mittels Surface Plasmon Resonanz [6]. Ein natürlicher
Regelmechanismus von Proteinkinasen führt über die Phosphorylierung
dieser Enzyme. PKAc z. B. verfügt, je nach
Isoform, über mindestens 4 Phosphorylierungsstellen. Diese
Phosphorylierungen haben wir mittels Massenspektrometrie,
Kristallstrukturaufklärung und NMR untersucht
[7-9].
Die Wirkung zahlreicher Hormone wird über Änderungen
des intrazellulären cAMP-Spiegels vermittelt. Hauptwirkort
dieses sekundären Botenstoffes ist das Enzym, PKA. Die
vielfältigen und für das jeweilige Hormon spezifischen
zellulären Antworten lassen sich nur durch subzellulär unterschiedliche
Verfügbarkeiten und individuell besondere
Eigenschaften von PKA und PKA-Isoenzymen erklären.
Genetisch kennt man Cα, Cβ, Cγ, sowie Cβ2 (entdeckt
und kloniert in der Abteilung), und einige andere Splicevarianten.
Cβ2 ist insofern ungewöhnlich, als es eine aminoterminale
Extradomäne aufweist. Gegenwärtig untersuchen
wir die Rolle von Cβ2 und seiner Extradomäne im
Hinblick auf biochemische und biologische Wirkungen, wie
Regulation, Protein-Proteinwechselwirkung, Translokation
und Substraterkennung [10].
Die Zelloberfläche als Reaktionszentrum und
Angriffsziel
Proteinkinasen der Zelloberfläche und
extrazelluläre Proteinphosphorylierung
D. Kübler, D. Gosenca, S. Elsner
In Zusammenarbeit mit: Intern: Prof. W.D. Lehmann und Dr. M.
Wind (B090), Dr. H. Heid (A010)
Extern: Prof. W. Jahnen-Dechent (Universität Aachen), Prof. I.
Friedberg, (Universität Tel Aviv, Israel).
An der Entwicklung von Zellen und ihrer Einbindung in die
zelluläre Umgebung sind enzymatische Aktivitäten der
Zelloberfläche beteiligt. Durch diese Enzyme können sowohl
gebundene Substrate auf der Zelloberfläche als auch
fremde Substrate aus der Zellumgebung verändert werden.
Die von uns an vielen Zellen nachgewiesenen Ser/
Thr Proteinkinasen an der Zelloberfläche (Ekto-PK) besitzen
Eigenschaften cAMP-abhängiger PK (PKA) und von,
Proteinkinasen CK1 und CK2, wobei letztere im Tandem von
intakten Zellen in das extrazelluläre Kompartiment freigesetzt
werden können. Ekto-PK ermöglichen es Zellen,
Substratproteine in ihrer biologischen Wirkung spezifisch
und reversibel zu verändern und bestätigen damit, dass
das mächtige Werkzeug der Proteinphosphorylierung auch
außerhalb der Zellen genutzt wird und als Mechanismus
der extra-intrazellulären Signalvermittlung wirkt. Zu den Substraten
von Ekto-PK gehören Proteine mit unterschiedlichen
Funktionen wie Wachstumsfaktoren, Hormone, Entzündungsmediatoren
oder Komponenten der extrazellulären
Matrix. Eine ständig wachsende Zahl von Literaturdaten zu
normalen und maligne veränderten Prozessen unterstreicht
die zentrale Rolle extrazellulärer Proteinphosphorylierungen.
Ekto-PK und ihre Substrate bieten somit wichtige pharmakologische
und therapeutische Ziele.
Ekto-PK-Substrate der Zelloberfläche können radioaktiv
markiert werden und zeigen sich nach SDS-Gelelektrophorese
und Autoradiographie als Zelltyp-spezifische Spektren
von Phosphoproteinen. Ihre Identifikation sind von
hohem Interesse für das Verständnis ihrer biologischen Funktion.
Mit immunologischen und biochemischen Methoden
einschließlich Mikrosequenzierung und Massenspektroskopie
ließen sich Homologe von bisher nur intrazellulär erwarteten
Abteilung A060
Pathochemie
Proteinen nachweisen. Die funktionelle Charakterisierung
dieser sowie anderer Ekto-PK Substrate, die Mechanismen
ihrer Expression als Zelloberflächenproteine und vergleichende
Untersuchungen an Normal- und Tumorzellen sind Ziele
laufender Arbeiten.
Im Zusammenhang mit der Wirkung extrazellulärer Nukleotide
(ATP) als Proliferationshemmer transformierter und Tumorzellen
wurde das für die Inhibition vermutlich entscheidende
Protein aus dem Zellüberstand isoliert und als Plasma-Glykoprotein
identifiziert. Die Hemmaktivität dieses
extrazellulären Inhibitors wird durch Phosphorylierung reguliert
und korreliert mit der Inaktivierung von Wachstumsrezeptor-gekoppelter
Tyrosinkinase-Aktivität und nachgeschalteter
Signalwege. Die molekulare Struktur des Inhibitors,
der vermutlich aus Vorläufern aktiviert wird [11]
und die Identifizierung seiner Phosphorylierungsstellen [12]
deuten auf ein komplexes Zusammenspiel verschiedener
Proteindomänen hin. Mechanismen zur Aktivierung dieses
Wachstumsinhibitors aus Vorläufern, seiner Phosphorylierung
sowie die Suche nach Rezeptoren auf Zielzellen bilden
Schwerpunkte der weiteren Untersuchungen zum Verständnis
der ATP-induzierten Tumorzellhemmung. Diese Kenntnisse
werden für die Entwicklung anwendungsbezogener
Konzepte von Bedeutung sein.
Kontrolle des Zellzyklus am G2/Mitose Übergang
V. Kinzel, N. König, J. Richards
In Zusammenarbeit mit Prof. W. D. Lehmann, Dr. M. Wind und M.
Salek (Abt. B090)
Vielzellige Organismen kontrollieren die Vermehrung ihrer
Zellen durch meist reversibles Anhalten im Zellzyklus, unter
anderem auch am Übergang von G2 Phase zur Mitose. Zur
Steuerung spielen dabei Proteinphosphorylierungs-,
Dephosphorylierungsvorgänge und damit natürlich auch die
verantwortlichen Katalysatoren - Kinasen und Phosphatasen
- eine entscheidende Rolle. Die Kenntnis der Regulation
dieser Enzyme ist daher die Voraussetzung für das Verständnis
der normalen sowie der gestörten Zellzykluskontrolle.
Unser Interesse gilt der Proteinphosphatase 2A (PP2A),
deren Aktivitätsminderung wir am G2/Mitose Übergang und
in Mitose zeigen konnten. Eine unzeitgemäße Reaktivierung
des in G2 Phase schon gehemmten Enzyms führt
zum sofortigen Stop des Übertritts der Zelle in die Mitose.
Möglicherweise ist für die Aktivitätsminderung der PP2A in
G2 Phase und Mitose eine spezielle Phosphorylierung der
katalytischen Untereinheit (PP2A C) verantwortlich, wie
Befunde mit Antikörpern andeuten. Allerdings gelang es
bisher nicht, PP2A C-gebundenen Phosphor bei aus
Mitoszellen gereinigtem Enzym direkt nachzuweisen - vermutlich
wegen der hohen Kapazität des Enzyms, sich selbst
zu dephosphorylieren. Gegenwärtig wird ein Vorgehen
ausgearbeitet, die Autodephosphorylierung bei der Analyse.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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