MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
Strukturdeterminanten von Proteinen
J. Reed, D. Mihailescu, K. Gehenn, K. Weise
In Zusammenarbeit mit: Prof. J.C. Smith (Universität Heidelberg),
Prof. D. Langosch (Technische Universität München)
Zusatzfinanzierung: HGF Strategiefond, VW-Stiftung
In jüngster Zeit wurde immer deutlicher, daß in einer Reihe
von Fällen Domänen eines Proteins, die für eine bestimmte
Funktion verantwortlich sind, in isolierter Form -
ohne den Kontext der nativen Proteinmatrix - sowohl ihre
Struktur als auch ihre Funktion bewahren. Dies erleichtert
Untersuchungen von Struktur / Funktionsbeziehungen bei
solchen Domänen ganz erheblich, weswegen solche Studien
heute in der medizinischen Grundlagenforschung sowie
bei der gezielten Entwicklung von Medikamenten üblich
sind. Diese Gruppe benützt biophysikalische Techniken wie
Cirkulardichroismus- (CD) und magnetische Kernresonanzspektroskopie
(NMR) in Verbindung mit computergestützter
Molekülmodellierung zur Analyse kritscher Kontrollaspekte
bei Proteindomänen von medizinischem Interesse -
zum einen, was Liganden-Rezeptor Wechselwirkungen im
allgemeinen betrifft, zum anderen, wie posttranslationale
Strukturveränderungen die biologische Aktivität beeinflussen.
Der Konformations-Schalter im HIV1 Hüllprotein
Der Befund dieser Gruppe, daß die CD4 Bindungsdomäne
des Glykoproteins gp120 von HIV1 einen konservierten
Konformations-Schalter enthält, d.h. einen Abschnitt, der
eine kooperativen Umfaltung von einer β-Struktur zu einer
3 Helix bei Membranbindung erfährt, ermöglichte zwei
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Ansätze für eine neue Form anti-viraler Therapie. Beide
zielen auf die Blockade des initialen Infektionsschrittes, der
Bindung des Virus an den CD4 Rezeptor von Wirtszellen.
Die Tatsache, daß die kooperative Umfaltung der Schalterdomäne
absolut nötig ist zur Bindung an CD4, führte
zur Suche nach Verbindungen, die diese Kooperativität
hemmen. Die Suche war erfolgreich. Diese Substanzen
verhindern in der Tat die Rezeptorbindung des gp120 Fragments
an CD4 exprimierende Zellen. Im Zuge der Verfeinerung
mit Hilfe von QSAR und Molekülmodellierung wurden
Faltungs-Hemmer hergestellt mit einer ID im niedri-
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gen nanomolaren Bereich, die auch nicht toxisch waren in
Zellkulturen. An diesem Punkt schien das Projekt reif für
eine industrielle Weiterentwicklung, die mit einer Steinbeis
GMBH eingeleitet wurde (Transferzentrum für angewandte
Biologische Chemie und Transferzentrum Glykoconjugate).
Das hohe Maß der Konservierung der Faltungseigenschaften
der CD4 Bindungsstelle von gp120 - trotz einer erheblicher
Sequenzvariabilität - eröffnet zusätzlich einen neuen
immunologischen Ansatz. Die Strategie besteht in der präzisen
Bestimmung des Peptid-Rückgrats dieser Domäne in
freier, d.h. nicht an CD4 gebundener Form. Da die Strukturbestimmung
durch 1H-NMR infolge ausgeprägter Aggregatbildung
nicht möglich war, wurde eine neue Strategie verfolgt,
bei der die NMR-Peptidstruktur in drei unterschiedlichen
organischen Lösungsmitteln unterschiedlicher Polarität
bestimmt wurde. Diese Strukturen dienten dann als
Grundlage für ein dynamisches Peptidmodelling in einer virtuellen
Wasserbox. Im Falle sehr ähnlicher Strukturen, war
davon auszugehen, dass diese Struktur energetisch günstig
ist und demzufolge die aktuelle Peptidkonformation
darstellt. Diese Arbeit war erfolgreich [13,14] und die so
definierte Struktur des Peptidrückgrades wurde zur Analyse
von Sequenzen aus 19 verschiedenen HIV1 Stämmen
Abteilung A060
Pathochemie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
(8 aus Gruppe M und 1 aus Gruppe O) herangezogen. Die
Oberflächenladung in der jeweiligen Lösung für jede
Peptidkonformation sowie die Werte für Hydrophobizität/
Hydrophilität wurden bestimmt. Die Oberflächen-Ladungsverteilung
für die verschiedenen HIV1 Stämme zeigten sich
signifikant verschieden, ein einsichtiger Grund, warum
Stamm-unabhängige Immunantwort schwierig auszulösen
ist. Im Gegensatz zur Sequenz Variabilität blieb das Hydrophobizität/Hydrophilitäts-Profil
relativ unverändert.
Der vermutete pharmakophore footprint wurde durch Konstruktion
von Durchschnittswerten aus Ladungsverteilungen
an der Peptidoberfläche untersucht. Hierbei entfielen Unterschiede
innerhalb von HIV1 Stämmen, während konservierte
Merkmale erhalten blieben. Die Resultate zeigten,
dass die scheinbaren Unterschiede eine innewohnende
Identität verdecken. Die Kombination von konstanter
Oberflächenladungsprofilen mit Hydrophobizität/Hydrophilitäts-Profilen
als Eigenschaft aller Stämme resultierte in der
Etablierung des konservierten pharmakophoren footprints
[15]. Dieses Ergebnis soll als Vorlage zur entsprechenden
Antigengewinnung genutzt werden, die möglicherweise
in eine erfolgreiche Stimulation von auf breiter Basis neutralisierender
Immunantwort mündet.
Fusionsfördernde Peptide
Die Fusion von biologischen Membranen ist essentiell bei
zahlreichen zellulären Prozessen und unterliegt vielen mikrobiellen
Infektionen. Meist wird sie in gezielter Weise durch
einen Satz spezialisierter Peptide induziert. Es wäre medizinisch
nützlich, diesen Vorgang kontrollieren zu können,
doch ist nicht bekannt, wie fusionsfördernde Peptide arbeiten.
In einem von der VW Stiftung geförderten Projekt
versuchen wir herauszufinden, welche Eigenschaften dieser
ziemlich kurzen Peptide für die Fusion verantwortlich sind.
Frühere Arbeiten zeigten, dass die Fusionsfähigkeit der
Fusionspeptide aus Synaptobrevin II and Syntaxin 1A von
der Konformationsflexibilität und seiner Bindungs-abhängigen
Faltung abhängt. Wir haben auf dieser Grundlage versucht,
rein synthetische Fusionspeptide zu entwerfen. Eine
Familie von Peptiden mit α-helikalen und β-Faltblatt fördernden
Resten (Leucin und Valin), entweder alternierend
oder als Homopolymere, wurde entwickelt. Jede davon
enthält drei N-terminale und drei C-terminale Lysinreste zur
Förderung der Löslichkeit und einen Tryptophanrest für
die rasche Proteinbestimmung. Das Fusionsverhalten dieser
Peptide wurde in der Arbeitsgruppe Prof. Langosch und
die Korrelation des Fusionsverhaltens mit den jeweiligen
Peptidstruktur mittels CD Spektroskopie wurde von uns
untersucht. Initiale Ergebnisse zeigen, dass in diesen synthetischen
Peptiden die Fusionseigenschaft unabhängig von
Selbst-Assoziationen sind. Andererseits ergibt sich eine
strenge Korrelation zwischen Konformationsflexibilität und
der Fähigkeit mit Membranen zu fusionieren. Die Untersuchungen
werden mit Peptidvarianten (Prolin- und/oder
Glycinreste werden eingeführt) zur Verbesserung der Präsentation
fortgesetzt.
Peptidsequenzen mit Schaltereigenschaften
Obwohl der β → α Konformationsschalter zuerst in gp120
aus HIV1 entdeckt wurde, zeigten Folgeuntersuchungen,
dass Polaritäts-abhängige Konformationsschalter dieses Typs
weitverbreitete Motive in Proteinen sind. Während der
Arbeiten an gp120 konnte ein großer Teil des Mechanismus
der kooperativen Rückfaltung erlernt und einige wesentliche
Komponenten solcher Sequenzen identifiziert
werden. Diese beinhalten a) eine N-terminale Tetrade,