MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
mosomale und molekulargenetische Veränderungen beobachtet.
Diese sprechen dafür, dass aufgrund der gleichen
Lokalisation auch die gleichen Noxen eine schädigende
Wirkung auf die Zellen haben können und es deshalb auch
zu ähnlichen Aberrationen in diesen zwei ganz unterschiedlichen
Tumortypen kommen kann. Übereinstimmend hiermit
herrschte in nicht-Hauttumoren ein wesentlich anderes
Spektrum von chromosomalen Aberrationen vor [2,
3].
Darüber hinaus fanden wir bei diesen Studien auch einen
neuen Polymorphismus im Kodon 27 des Harvey-ras Gens
[1]. Dieser Polymorphismus wurde wesentlich häufiger in
den Tumorzelllinien beobachtet als in Kontroll-DNA von gesunden
Probanden. In einem Fall korrelierte die Tumorentwicklung
sogar mit dem Verlust des Wildtyp Allels.
Weiterführende Untersuchungen mit einer größeren Zahl
von Hautcarcinomen und Kontroll-DNAs müssen nun zeigen,
wieweit es sich bei diesem ras Gene Polymorphismus
um ein mögliches Prädispositionsgen handelt und wenn ja,
welche funktionellen Veränderungen dadurch bedingt sind.
1c. Entstehung von genetischen Aberrationen
In ersten Untersuchungen, wie es zu solchen chromosomalen
Aberrationen kommen kann und warum spezifische
Chromosomen miteinander Austausche (Translokationen)
eingehen können, wurden Interphase Kerne von Lymphozyten
nach ionisierender Bestrahlung analysiert. Diese Studien
zeigten, dass in der Tat Chromosomen-Assoziationen
nach Bestrahlung nachweisbar waren, dass aber grundsätzlich
die Chromosomenverteilung zufällig zu sein scheint [6].
In neuesten Untersuchungen haben wir nun auch die dreidimensionale
(3D) Lokalisation der Telomere mit einbezogen.
Mittels hochauflösender Mikroskopie, Dekonvolution
und Berechnung der 3D Struktur im Kern können wir nun
erstmals nachweisen, dass die Telomere ganz bestimmte
Territorien einnehmen, dass deren Lokalisation sich Zellzyklus-abhängig
verändert und, von besonderem Interesse
für die Tumorentstehung, dass diese Organisation in
Tumorzellen gestört ist. Mit diesen Ansätzen hoffen wir
nun auch klären zu können, warum für Hautcarcinome Translokationen
mit großen Bereichen der verschiedenen Chromosomen
charakteristisch sind, während kryptische
subtelomerische Rearrangements die Hauptursache für
mental Retardation ist [7].
2. Telomeraseaktivierung eine besondere Form
der genetischen Aberration: Telomerase-,
und Telomerlängenregulation in normalen
and transformierten humanen Keratinozyten
(A110-2)
P. Boukamp, S. Beneke, F. Bub, A. Cerezo, S. Ermler,
S. Moshir, S. Rosenberger, H. Stammer
In Kooperation mit: Dr. J. R. Bickenbach, University of Iowa,
Iowa City, USA; Dr. M. Hergenhahn, DKFZ; Kirsten Vang Nielsen,
DAKO Dänemark, Prof. Holger Kalthoff, Universität Kiel
Wesentliche Erkenntnisse der letzten zwei Jahre waren:
1. Telomerase unterliegt einer komplexen Regulation und
ein neuer Regulationsmechanismus ist alternatives
Splicing des hTERT Gens.
2. Die Regulierbarkeit der Telomerase ist essentiell für die
normale epidermale Differenzierung.
Abteilung A110
Genetik der Hautcarcinogenese
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Regulation der Telomeraseaktivität und
Telomerlänge
Normale Zellen verlieren Replikations-bedingt kontinuierlich
Sequenzen am Ende der Chromosomen, den Telomeren,
und man geht davon aus, daß dieser Telomerverlust für
die begrenzte Lebensspanne der normalen Zellen verantwortlich
ist. D.h. der Verlust von Telomersequenzen ist
der Zählmechanismus, die innere Uhr der “zellulären Alterung”.
Diese Telomerhypothese der zellulären Alterung hat
sich inzwischen auch gegenüber allen anderen Hypothesen
der Zellalterung als die Wahrscheinlichste durchgesetzt
[6].
Um uneingeschränkt proliferieren zu können, müssen z.B.
immortale und Tumorzellen einen Mechanismus aktivieren,
der es ermöglicht, dass die Telomerverkürzung unterbunden
wird. Dies geschieht in den meisten Fällen durch die
Aktivierung des Ribonukleoprotein Komplexes Telomerase.
Telomerase kann de novo Telomersequenzen synthetisieren
und damit den Proliferations-bedingten Telomerverlust,
der weiterhin stattfindet, ausgleichen. Ein wichtiger Faktor
in der Behandlung dermatologischer Erkrankungen ist
die Psoralen Photoaktivierung (PUVA Behandlung). In normalen
Fibroblasten kommt es dadurch aber zu einem Langzeitarrest,
der mit morphologischen und biochemischen Veränderungen
einhergeht. Diese sind sehr ähnlich solchen,
die man charakteristischerweise bei der Zellalterung, auch
Seneszenz genannt, beobachtet. Ein wesentlicher Unterschied
ist aber, dass die PUVA-behandelten Zellen schließlich
wieder proliferieren können. Dieser Wiedergewinn der
Proliferation ist jedoch kein Zeichen für die Immortalisierung
der Zellen, denn wie wir zeigen konnten, blieben diese
Zellen Telomerase-negativ [7]. Ebenso kann die Einführung
der frühen Gene E6 und E7 des humanen Papillomvirus
HPV 38 zwar die Lebensdauer von humanen Keratinozyten
verlängern, aber die hohe Telomeraseaktivität,
die man normalerweise in Tumorzellen beobachtet, wurde
dadurch nicht induziert [8]. D.h. es bleibt weiter ungeklärt,
welche Rolle die abnorme Proliferation für die Telomeraseaktivierung
spielt.
Es ist aber unumstritten, dass die katalytische Untereinheit
der Telomerase - hTERT - der restriktive Anteil des
Telomerasekomplexes ist. Interessanterweise ist c-Myc, das
eine wichtige Rolle in der Proliferation spielt, auch ein wichtiger
Aktivator des hTERT Gens. Durch konstitutive Expression
des c-myc Gens in unserem HaCaT Modell konnten
wir nachweisen, dass c-Myc auch ein wichtiger Aktivator
für hTERT in den Keratinozyten ist [9]. Darüber hinaus
war es uns aber auch erstmals möglich, zu zeigen, dass
hTERT nicht nur durch transkriptionelle Aktivierung oder
Repression reguliert werden kann, sondern auch durch alternatives
Splicing [9]. Die Behandlung der HaCaT Zellen
mit dem Transformierenden Wachstumsfaktor Beta (TGFβ1)
führt üblicherweise zu Inhibition von c-Myc. Dies wiederum
bedingt die Repression von hTERT und damit den
Verlust der Telomeraseaktivität. Bei konstitutiver c-Myc
Expression in den HaCaT-myc Zellen kommt es nicht mehr
zur TGF-β-abhängigen Hemmung der Proliferation, aber die
Telomerase wird dennoch abgeschaltet. Das hTERT Gen
hat 4 prominente Splicevarianten, von denen aber nur eine
katalytisch aktiv ist. In den HaCaT-myc Zellen bleibt aufgrund
der unveränderten c-Myc Expression auch hTERT
exprimiert, es werden aber nun nur ausschließlich inaktive
Varianten exprimiert, d.h. Varianten die im Komplex keine
Aktivität und damit auch keine Telomerlängenstabilisierung
bewirken können [9]. Damit kann TGF-β1 die Telomerase