MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt E
Innovative Krebsdiagnostik und -therapie
Fortschritte in der Festphasen-Peptidsynthese ermöglichen
eine facettenreiche Produktion von Molekülen, die als
potenzielle Therapeutika Einsatz finden könnten [4]. Hierzu
zählen die protease- und nukleaseresistenten Peptidnukleinsäuren
(PNA), bei denen das Zucker-Phosphat-Rückgrat
durch Ethylen-Amin verbundene α-Amino-Ethyl-Glycin-
Einheiten substituiert ist. PNAs sind in der Lage mit Komplementärsequenzen
in höherer Affinität zu hybridisieren (Ausbildung
einer Hoogsteen Bindung) verglichen mit analogen
DNA- oder RNA-Oligomeren. Allein der unzureichende
zelluläre Import von PNAs ist der zentrale limitierende Faktor
und erfordert ein effizientes Carrierystem.
Der Transfer durch die Zellmembran und Kernhülle wird
durch eines von uns entwickelten nicht-viralen modular
aufgebauten Transport-Systems erzielt. Dieser sog. „Bio-
Shuttle“ besteht aus einem modularen Transport- und
Adresspeptide mit „Sollbruchstellen“, das den effizienten
zytoplasmatischen Transport plus der präzisen Adressierung
in Zellkompartimente gewährleistet. Das Adressproteinmodul
(Nuclear Localisation Site (NLS)) ermöglicht den
Transport von Wirksubstanzen in den Zellkern, wie PNA
oder DNA, in geringeren Konzentrationen als bisher. Von
Bedeutung ist das Vorhandensein einer im Zytoplasma
spaltbaren Redox-Kopplung zwischen Transport- und
Adressmodul.
Mittels Konfocaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und
Fluoreszenz Korrelation Spektroskopie (FCS) konnte der
zellkerngerichtete Transport gezeigt werden. Hierzu wurden
DU-145 Zellen mit dem BioShuttle, das zum einen eine
spaltbare und zum anderen eine nicht-spaltbare Disulfid-
Kopplung besitzt, inkubiert. Wir konnten zeigen, dass eine
grüne Fluoreszenz im Zellkernbereich auftritt, wenn eine
spaltbare Disulfid-Kopplung eingesetzt wird. Bei Applikation
des BioShuttle-Konjugates ohne spaltbare Disulfid-Kopplung
konnte kein Fluoreszenzsignal im Zellkern detektiert
werden, es ist lediglich eine Mischfluoreszenz im Zytoplasma
sichtbar, weil dann die NLS-Sequenz nicht erreichbar ist
[5].
Unsere Ergebnisse zeigen einen effektiven, kompartimentgerichteten
Transport in lebende Zellen mit Hilfe eines
synthetisch hergestellten, modularen, nicht toxischen
Oligopeptid-Transporters.
Penetratin-S-S-NLS-KK-PNA Penetratin-NLS-KK-PNA
¦ ¦ ¦ ¦
Alexa-Labelling FITC-Labelling Alexa-Labelling FITC-Labelling
Abb. 1: DU-145 Zellen inkubiert mit dem BioShuttle, mit und ohne
Disulfid-Kopplung, welche zusätzlich zwei Fluorenzfarbstoffe
(Alexa und FITC) einmal vor und einmal nach der Disulfid-Kopplung
besitzen.
Auf Grundlage des entwickelten BioShuttles haben wir ein
auf antisense-basierendes Molekül für die molekulare Bildgebung
(Molecular Imaging) entwickelt. Mit Hilfe des Molecular
Imaging (MI) können biologische Prozesse auf zellulärer
und molekularer Ebene im lebenden Organismus gemessen
und charakterisiert werden. Im Gegensatz zu herkömm-
Abteilung E050
Klinische Kooperationseinheit Strahlentherapie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
lichen diagnostischen Bildgebungsverfahren werden nicht
anatomische Ausprägungen oder Effekte einer bestimmten
Krankheit detektiert, sondern biologische Prozesse, die
der Krankheit zugrunde liegen, auf zellulärer Ebene nachgewiesen.
Dadurch lassen sich Krankheiten bereits im Frühstadium
erkennen und im Idealfall noch vor Erscheinen des
eigentlichen Krankheitsbildes therapieren.
Fortschritte in der Magnet Resonanz Bildgebung (MRI) mit
dem Kontrastmittel Gadolinium (Gd) konnten die Präzision
in der Diagnostik deutlich verbessern. Dennoch ist eine
zelluläre Darstellung nicht möglich im Gegensatz zur
extrazellulären, intravasalen Darstellung mit dem handelsüblichen
Gd-Kontrastmittel. Vorraussetzung für eine MI-
Methode in der MRI ist das eindringen des Gd-Kontrastmittels
in die Zelle. Aus diesem Grund haben wir das weit
verbreitete, interstitielle Gd-Kontrastmittel durch Design
eines Antisense-Conjugated-Gadolinium-Transporter (ACGT)
so weit verändert, dass eine zellspezifische intrazelluläre
Aufnahme möglich ist.
Dieses modulare Konstrukt besteht aus einem Gd3+ -Komplexmodul,
das an ein Transmembran-Transportmodul gebunden
ist, welches wiederum mit einem Addressmodul
(hier eine c-myc mRNA gerichtete Antisense-Sequenz)
verbunden ist.
Mit Hilfe der MRI, konnten wir das Element Gadolinium sowohl
in Zervix Karzinomzellen (Hela) als auch in Nicht-Tumorzellen
(Lymphozyten) nachweisen. Unser ACGT-Konstrukt
wurde im Experiment rasch aus den Nicht-Tumorzellen
wieder heraustransportiert im Gegensatz zu den Tumorzellen,
bei denen das Konstrukt aufgrund der Antisense
c-myc mRNA weitgehend intrazellulär gebunden wurde.
Der dadurch erzeugte Unterschied im Kontrast erlaubt
Tumor- von Nicht-Tumorzellen zu unterscheiden [6-9].
Publikationen (* = externe Koautoren)
[1] Corban-Wilhelm,H., Becker,G., Bauder-Wust,U., Greulich,D.,
Debus,J., Cytosine deaminase versus thymidine kinase: a comparison
of the antitumor activity, Clin. Exp. Med., 3 (2003) 150-
156
[2] Corban-Wilhelm,H., Ehemann, V., Becker,G., Greulich,D.,
Braun, K., Debus,J., Comparison of different methods to assess
the cytotoxic effects of cytosine deaminase and thymidine kinase
gene therapy, Cancer Gene Therapy, Epub ahead of print (2003)
[3] Corban-Wilhelm,H., Hull,W.E., Becker,G., Bauder-Wust,U.,
Greulich,D., Debus,J., Cytosine deaminase and thymidine kinase
gene therapy in a Dunning rat prostate tumour model: absence
of bystander effects and characterisation of 5-fluorocytosine
metabolism with (19)F-NMR spectroscopy, Gene Ther., 9 (2002)
1564-1575
[4] Pipkorn R., Waldeck W., Braun K. Synthesis and Application of
functional Peptides in the Treatment of malignant Diseases. Review
Article. J Mol Recognit, 16 (2003) 240-247
[5] Braun,K., Peschke,P., Pipkorn,R., Lampel,S., Wachsmuth,M.,
Waldeck,W., Friedrich,E., Debus,J., A biological transporter for
the delivery of peptide nucleic acids (PNAs) to the nuclear compartment
of living cells, J. Mol. Biol., 318 (2002) 237-243
[6] Heckl,S., Debus,J., Jenne,J., Pipkorn,R., Waldeck,W.,
Spring,H., Rastert,R., von der Lieth,C.W., Braun,K., CNN-Gd3+ enables Cell Nucleus Molecular Imaging of Prostate Cancer Cells -
the last 600 nm-, Cancer Res., 62 (2002) 7018-7024
[7] Heckl S, Debus J, Pipkorn R, Rastert R, Waldeck W, van Kaick
G, Braun K, Novel Transporter for Gadolinium enables fast and
specific cellular uptake into tumor cells. Mol Imag; 1(2) (2002)
125
[8] Heckl S., Braun K., Debus J.. Molekular Imaging – A Future
Diagnostic Method in Neurooncology? Tumor Diagnostik und
Therapie, 23 (2002) 209-218