MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt E
Innovative Krebsdiagnostik und -therapie
und Nicht-Tumor Zell-Linien (HUVEC, HaCaT, HaCaT-RT3)
erfolgten mit FACS zur Kontrolle der Spezifität der GLUT1
Regulation des EGFP-Gens in Tumorzellen. Ferner wurden
Versuche zur Aufnahme von 3H-Gancyclovir und zur Toxizität
des HSVtk/Gancyclovir-Systems nach transienter Infektion
der Zellen mit den verschiedenen AAV-Partikeln und Inkubation
mit Gancyclovir durchgeführt.
Tumorzellen und die ras-transformierte Zell-Linie HaCaT-RT3
zeigten eine signifikante Reduktion in der Zellzahl (HCT116:
55,05%; MH3924A: 42,91%, HaCaT-RT3: 34,29%). Weiterhin
wurde eine Reduktion des 3H-Thymidin-Einbaus in
die DNA nach Inkubation mit GCV beobachtet (HCT116:
37,75%; MH3924A: 32,79%; HaCaT-RT3: 36,33%). Evidenz
für die Phosphorylierung des HSVtk Substrats GCV
wurde in allen Tumorzell-Linien gefunden (HCT116:
80,26%; MH3924A: 74,51%; HaCaT-RT3: 257,41%), nicht
jedoch in Nicht-Tumor-Linien. Um auszuschließen, dass die
rAAV/GTI-1.3 Partikel auch Promotoraktivität in Zellen des
Immunsystems und primären Gewebekulturzellen zeigen,
wurden T-Lymphocyten und humane primäre endotheliale
Zellen mit rAAV/GTI-1.3egfp infiziert. Eine FACS Analyse
ergab nur eine schwache Reportergenaktivität in allen Nicht-
Tumorzellen. Stabil mit HSVtk transduzierte MH3924A Zellen
zeigten eine gesteigerte Anreicherung des HSVtk Substrats
125I-Deoxycytidin. Die in vitro Daten sind Evidenz für eine tumorspezifische
Aktivität des GLUT1 Promotors/Enhancers. Kombiniert mit
dem Gen für HSVtk kann dieser therapeutische Ansatz
nicht-invasiv in vivo mittels spezifischer Substrate wie 131I deoxycytidin verfolgt werden.
Expression des Natrium Jodid Symporters unter
der Kontrolle des Glukosetransporter 1
Promotors
S. Sieger, A. Altmann, J.A. Kleinschmidt*,
U. Haberkorn
*F010 DKFZ
Gerichteter Transfer des Natrium Jodid Symportergens
(NIS) in Tumorzellen könnte zur Radiojodtherapie von Nicht-
Schilddrüsentumoren genutzt werden. Wir untersuchten
die Jodaufnahme in Hepatomzellen in vitro und in vivo nach
Transfer des hNIS G Gens unter der Kontrolle eines möglicherweise
tumor-spezifischen regulatorischen Elements,
dem Promotor des Glukosetransporter 1 Gens (GTI-1.3).
Mittels eines selbst-inaktivierenden bicistronischen retroviralen
Vektors für den Transfer des hNIS und des Hygromycinresistenzgens
wurden Morrishepatomzellen
(MH3924A) infiziert und anschließend hNIS-exprimierende
Zellen generiert. 125I- Uptake und Efflux-Messungen erfolgten
in genetisch modifizierten und Wildtyp-Zellen. Ferner
wurde die Jodid-Verteilung in Ratten mit Wildtyp und genetisch
modifizierten Hepatomen erfasst.
HNIS-exprimierende MH3924A-Zellen reicherten bis zu 30fach
mehr Jodid an als Wildtypzellen mit einem maximalen
Jodiduptake nach 30 Minuten. Kompetitionsexperimente
in Anwesenheit von Natriumperchlorat zeigten einen Abfall
des Jodiduptakes (80% to 84%). Ouabain führte ebenfalls
zu einer verminderten Anreicherung (81%) während
DIDS den I-Uptake steigern konnte (87%). Ein rascher
Efflux der Radioaktivität (70%) wurde 20 Minuten nach
Austausch des Kulturmediums beobachtet. Lithium hatte
in vitro keinen positiven Effekt auf den Efflux. In vivo reicherten
die hNIS-exprimierenden Tumore 22-fach mehr
Abteilung E060
Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin
Jodid an als Wildtyp-Tumore. Auch hier wurde ein rascher
Efflux beobachtet. Dosimetrische Berechnungen ergaben
eine absorbierte Dosis von 85 mGy in Wildtyp-Tumoren und
830 mGy in hNIS-exprimierenden Tumoren nach Gabe von
18.5 MBq 131 I. Die Transduktion des hNIS Gens unter der
Kontrolle des GLUT1 Promotorelements induziert also gesteigerten
Jodidtransport in Morrishepatomen in vitro und
in vivo. Für eine therapeutische Anwendung sind jedoch
weitere Modifikationen, die den Jodid-Efflux hemmen, nötig.
Messung von AP1 Aktivierung nach Transfer
des humanen Natrium-Jodid Symporter Gens
A. Altmann, U. Haberkorn
Ziel war die Konstruktion eines Reportersystems zur Visualisierung
von Stressreaktionen durch Monitoring der Induktion
des activator protein 1 (AP1) und des stress-activated
protein kinase/Jun N-terminal kinase (SAPK/JNK)
Signaltransduktionswegs.
Zunächst erfolgte die Klonierung eines Expressionsvektors
mit den Genen für den humanen Natrium Jodid Symporter
(hNIS) und Hygromycinresistenz unter der Kontrolle von 4
Tandemkopien des AP1 Enhancers fusioniert mit dem minimal
Herpes simplex virus Thymidin Kinase Promoter. In
diesem Konstrukt induziert die Bindung von Transkriptionsfaktoren
an AP1 die Transkription des Reportergens. Zur
simultanen Expression der Gene für hNIS und Hygromycinresistenz
sowie zur Stabilisierung der mRNA wurde
ein synthetisches Intron und eine internal ribosomal entry
site (IRES) des Encephalomyocarditis Virus zwischen die
Gene kloniert. Nach Lipofektion von humanen Cervixkarzinomzellen
(HeLa) und Rattenhepatomzellen (MH3924A)
und Selektion stabiler Zell-Linien wurden Jodid Uptake Experimente
mit und ohne Anwesenheit eines Phorbol Esters
(TPA) durchgeführt.
Bei Hela Zellen wurde in Abwesenheit von TPA kein Unterschied
zwischen Wildtyp und genetisch modifizierten
Zellen beobachtet. Zugabe von TPA führte jedoch zu einer
11-fachen Steigerung der Jodid-Anreicherung. Dieser
Anstieg war dosis-abhängig mit einem Plateau bei 8 µM
TPA und zeitabhängig mit einem Plateau nach 6 h Stimulation
mit 8 µM TPA. Bei MH Zellen wurde ein bis zu 58facher
Anstieg der Jodanreicherung bereits in nicht-stimulierten
Zellen gemessen. Inkubation mit TPA führte zu einem
weiteren (1.7-fach) Anstieg des Uptakes
Wir fanden verschiedene Basalaktivitäten für den Jodidtransport
in genetisch modifizierten HeLa und Morris Hepatom
Zellen, was auf Unterschiede in der AP1 Aktivierung
bei diesen Tumorzellen hinweist. Stimulation des
regulatorischen Elements für AP1 führte zu einer Steigerung
des Jodid Uptakes in beiden Tumortypen. Systeme,
die regulatorische Elemente der Signaltransduktionswege
mit in vivo Reportergenen wie dem hNIS kombinieren,
könnten für die biologische Charakterisierung von Tumoren
sowie die nichtinvasive Charakterisierung von Signaltransduktionsaktivierung
eingesetzt werden.
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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