MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt A
Zell- und Tumorbiologie
dieser spezifischen Doppellokalisation für die Regulation des
Differenzierungsgeschehens gilt es nun aufzuklären.
I. Organisationsfaktoren und strukturbestimmende
Prinzipien zellulärer Filamentsysteme
Im jetzigen Zeitraum wurden in der Ermittlung der Molekülstruktur
von Intermediärfilament-Proteinen und der Auswirkung
von Punkt-Mutationen einzelner IF-Proteine auf
das Filament-Assembly entscheidende Fortschritte gemacht
[12, 17, 20, 53]. Weiterhin ergaben sich neue Hinweise
auf die Bedeutung assoziierter Proteine für die Integration
von IFs ins Cytoskelett, insbesondere für die Lamine. Es
konnte gezeigt werden, dass Mutationen im Lamin-B-Rezeptor
zur schweren erblichen Krankheiten führen, die mit
Fehlorganisationen des Chromatins einhergeben [10, 25,
46, 51]. Zur weiteren Charakterisierung der Interphase-
Chromosomen wurde der Interchromatin-Raum mit Hilfe
von mikroinjizierten, fluoreszenzmarkierten Dextran-Partikeln
in lebenden Zellen untersucht [16]. Der Einfluss von
Protein-Phosphorylierungsreaktionen auf die Dynamik von
Zell-Strukturelementen wurde schließlich anhand des
Vimentin-Nestin-Systems demonstriert [7]. Diese Ergebnisse
wurden in mehreren Übersichtsartikeln zusammengefasst
und im Zusammenhang diskutiert [19, 21, 22, 30,
54].
II. Keratin-Intermediärfilamente und keratinassoziierte
Proteine - Expression und Funktion
in speziellen epithelialen Bereichen
Die Proteine der Intermediärfilamente werden von einer
großen Multigen-Familie mit mehr als 60 Mitgliedern gebildet
und in mehrere Unterfamilien unterteilt. Sie bilden ein
filamentöses Netzwerk im Cytoplasma (IF-Cytoskelett) und
sind so wesentlich am Aufbau und der Erhaltung der
Zellform, der zellulären Stabilität und damit auch des
Gewebeverbandes beteiligt. Ihr Vorkommen kennzeichnet
in charakteristischer Weise bestimmte Zelltypen: z.B.
Vimentin mesenchymale Zellen, Desmin Muskelzellen, Gliaund
Neurofilamente Gliazellen bzw. Nervenzellen. Die größte
Unterfamilie bilden die Keratine, die in die Typ I (saure)
und Typ II (basische) Keratine unterteilt werden. Die Keratin-Familie
umfasst beim Menschen bis heute bekanntermaßen
mehr als 40 funktionelle Gene, zu denen die
Cytokeratine (epitheliale Keratine) und die Haarkeratine
(“harte” Keratine) gehören. Während die Cytokeratine
cytoskelettale Komponenten der Keratinocyten und anderer
epithelialer Zellen sind, finden sich die Haarkeratine
vorwiegend in den Trichocyten des haarbildenden
Kompartiments. Somit sind Keratine typische Strukturproteine
aller epithelialer Zellen. Ihr Expressionsmuster kennzeichnet
aber nicht nur die epitheliale Herkunft der Zellen,
sondern auch ihren Differenzierungszustand. Diese Eigenschaft
macht sie als “Marker”-Proteine in der Tumordiagnostik,
insbesondere für Carcinome, heute unentbehrlich
([32, 42]; s. a. Kap. V.).
In den vergangenen Jahren konnten wir die Expression
der menschlichen Typ I- (9 Gene; hHa1-hHa8, incl. zweier
Isoformen) und der Typ II- (6 Gene; hHb1-hHb6) Haarkeratine
aufklären. In umfangreichen Gen-Expressionsstudien
zeigten wir mittels in situ Hybridisierung und
Immunhistochemie (gegen alle Haarkeratine wurden spezifische
Antiseren hergestellt), dass die Haarkeratine - wie
die Cytokeratine - in einer differentiellen Abfolge z.T. in
bestimmten Strukturen (z.B. die Haar-Cuticula) gebildet
werden. Diese Expressionsstudien wurden auf Haarfollikel
in vitro [56] erweitert und die Filamentbildung in vitro [28]
Abteilung A010
Zellbiologie
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
untersucht. Ferner wurden Arbeiten zur Genregulation der
Haarkeratine über den Transkriptionsfaktor HoxC13 [31]
und über den Einfluß von Androgenen begonnen [66].
Eine weitere detaillierte Studie befasst sich mit den
Expressionsmustern der Haarkeratine im Nagel, wodurch
die verschiedenen Differenzierungsbereiche des Nagels
erstmals molekularbiologisch charakterisiert werden konnten
(Perrin et al., Manuskript im Druck).
Innerhalb unserer Studien wurden weitere neue Cytokeratine
entdeckt: K6irs1, K6irs 2, K6irs3 und K6irs4. Wir konnten
zeigen, dass ihre Synthese auf eine genau definierte
Struktur des Haarfollikels beschränkt ist, die innere Wurzelscheide
(IRS). K6irs1 wird in allen Bereichen der IRS, der
Henle- wie der Huxley-Schicht und der IRS-Cuticula synthetisiert.
K6irs2 und K6irs3 werden in sequentieller Abfolge
speziell in der IRS-Cuticula gebildet, während K6irs4 auf
die Huxley-Schicht beschränkt ist [39, 41]. K6irs 4 ist auch
in spezialisierten Zellen (“Flügelzellen”) nachweisbar, die die
Henle-Schicht durchdringen und mit diesem Marker eindeutig
als Huxley-Zellen identifizierbar sind. Ferner konnte
das vor einiger Zeit von uns entdeckte Cytokeratin K6hf,
das den sog. Companion Layer des Haarfollikels charakterisiert,
auch in der Haar-Medulla nachgewiesen werden [58].
Dies ist somit die erste Struktur des Haarfollikels, in der
sowohl Haarkeratine als auch Cytokeratine nebeneinander
vorkommen.
Die Arbeiten wurden erweitert, indem auch die Mitglieder
der großen Genfamilie der Keratin-assoziierten Proteine
(KAPs) einbezogen und deren Expressionsmuster dargestellt
wurde [47-50, 68]. KAPs vernetzen die Keratinfilamente
zu einer sehr festen Struktur, wie sie besonders
im Haar auftritt.
Die Arbeiten zur Synthese der Haarkeratine und die neu
entdeckten Cytokeratine im Haarfollikel sind Grundlagen
für Untersuchungen an Tumoren und anderer, genetisch
bedingter Krankheiten des haarbildenden Systems ([5, 61,
71]; s. a. Kap. V.).
III. Tight Junctions und Tight Junction-verwandte
Strukturen als wesentliche Zell-Zell-
Verbindungsstrukturen des epithelialen
Barriere-Systems
“Tight Junctions” (TJ) sind der wesentliche Bestandteil des
epithelialen Barrieresystems und dienen der Abgrenzung
innerer Körperhohlräume gegen ihre entsprechenden äußeren
Bereiche und somit gegen die freie Diffusion von
Stoffen. Das Vorkommen von Tight Junction-Strukturen,
einschließlich von Zonula occludentes in stratifizierten
verhornten und nicht-verhornten Epithelien, wird seit langer
Zeit kontrovers diskutiert und ihre Existenz bisher zweifelsfrei
nur für polare (einschichtige) Epithelien akzeptiert.
Erste, unerwartete Anhaltspunkte für das Vorkommen
solcher Strukturen in geschichteten Epithelien veranlassten
uns, eine Vielzahl dieser Epithelien verschiedener Spezies
sowie daraus abgeleiteter Zellkulturen systematisch zu
untersuchen. Dabei wurden vor allem die Elektronenmikroskopie
und die Immuncytochemie, sowohl auf licht- als auch
auf elektronenoptischer Ebene, eingesetzt. Der Schwerpunkt
lag hierbei auf den TJ-Proteinen Occludin, verschiedenen
Claudinen, Cingulin, ZO-1 und Symplekin [3, 38,
40]. Völlig unerwartet fanden sich, vor allem in den oberen
Schichten stratifizierter Epithelien, neben den “klassischen”
TJ-Protein positiven Strukturen, den “membrane
kisses”, eine Reihe neuer und in Größe sowie Struktur verschiedener
TJ-verwandter Strukturen: (a) “Lamellated TJs”