MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt F
Infektion und Krebs
Ad 1 a) Die Rolle des Transkriptonsfaktors AP-1
bei der HPV-induzierten Karzinogenese
U. Soto, J. de Castro, J. van Riggelen, F. Rösl
Kooperationen: Peter Angel, DKFZ, Bohdan Wasylyk, Institut de
Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire INSERM
Straßburg, Frankreich.
Anhand eines auf somatischen Zellhybriden basierenden
Modellsystems konnten wir zeigen, dass der Transkriptionsfaktor
AP-1 nicht nur, wie bisher angenommen, ausschließlich
eine Funktion als positiv regulierender Transkriptionsfaktor
bei der viralen Genexpression erfüllt, sondern
auch eine wichtige Schlüsselrolle in einem intrazellulären
Kontrollmechanismus einnimmt, welcher die HPV Transkription,
die Expression von Zytokinen/Chemokinen sowie
das Wachstum HPV-positiver Zellen in vivo bestimmt
(Soto et al., 1999; Oncogene 18: 3187-3198; Soto et al.,
2000; Int. J. Cancer 86: 811-817). Die Möglichkeit durch
gezielte Veränderung der AP-1 Zusammensetzung ein zentrales
Schlüsselprotein innerhalb der HPV-induzierten
Karzinogenese von einem positiv zum einem negativ wirkenden
Transkriptionsfaktor zu konvertieren, könnte sich
für die Therapie persistierender Papillomvirusinfektionen als
äußerst attraktiv erweisen (Rösl et al., 1997; J. Virol. 71:
362-370). Weiterhin konnte im Rahmen einer Kooperation
mit der Arbeitsgruppe um B. Wasylyk geklärt werden,
dass c-Fos, dessen Überexpression nicht-maligne HPV-positive
Zellen zur Malignität konvertiert, durch ein an der
Chromatinisierung beteiligtes Protein („Net“) (zur Übersicht,
siehe Buchwalter, et al., 2004; Gene, 324: 1-14) in nicht
tumorigenen HPV-positiven Zellen abgeschaltet ist und nur
nach Seruminduktion transkribiert wird. In malignen Zellen
ist die Expression konstitutiv. Dies zeigt erstmals die Beteiligung
von c-Fos am Transformationsgeschehen in der Virus-induzierten
Karzinogenese menschlicher Zellen auf [1].
Ad 1 b) Ektopische Expression des Retinoinsäurerezeptor
β in Zervixkarzinomzellen:
Suppression der AP-1 Aktivität
J. de Castro Arce, U. Soto, J. van Riggelen,
E. Schwarz, F. Rösl.
Wie in vielen menschlichen Tumoren ist die Expression des
nukleären Retinoinsäurerezeptor β (RARβ) auch in Zervixkarzinomzellen
oft dysreguliert (Geisen et. al., 1997; Cancer
Res. 57: 1460-1467). Ein zentraler Mechanismus wie RARβ
seine wachstumsinhibitorische Funktion entfaltet basiert
auf dessen Fähigkeit in Anwesenheit von Retinoinsäure als
Ligand den Transkriptionsfaktor AP-1 zu supprimieren (zur
Übersicht, siehe Altucci and Gronemeyer, 2001; Nat. Rev
Cancer 1: 181-193). Da bisher sehr wenig über die biologische
Funktion von RARβ in der Abwesenheit des Liganden
als Repressor bekannt ist, wurde die korrespondierende
cDNA stabil in RARβ-negative HPV18-positive HeLa-Zellen
eingebracht. In diesem Kontext konnten wir einen völlig
neuen Mechanismus der AP-1 Inaktivierung identifizieren.
Hierbei führte die konstitutive Expression “non-liganded”
RARβ zu einer drastischen Reduktion der Bindung und Aktivität
von AP-1, was mit der selektiven Degradation von c-
Jun als Hauptdimerisierungspartner begleitet war. Durch
Inhibition der Proteasom-vermittelten Proteolyse wird die
intrazelluläre c-Jun Menge wieder erhöht und die AP-1 Funktion
rekonstituiert. Werden darüber hinaus HeLa RARβ Klone
entweder mit TNFα behandelt oder mit einer konstitutiv
aktiven cDNA einer “upstream MAP kinase” (MEKK1∆) )
Abteilung F030
Virale Transformationsmechanismen
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
transfiziert, wird c-Jun re-phosphoryliert, in seiner Halbwertszeit
verlängert und damit ebenfalls die AP-1 Affinität und
Funktionalität wiederhergestellt. Dies zeigt, dass die AP-1
Funktion nicht irreversibel gestört ist, sondern durch Aktivierung
der Jun-N-terminalen Kinase (JNK) wieder reaktiviert
werden kann. Dies führt zu einem Modell, das erklärt, wie
AP-1 trotz Anwesenheit eines potentiellen Repressors
(RARβ) moduliert wird [2].
Ad 2a) Regulation der Chemokinexpression in
malignen und nicht-malignen HPV-positiven
Zellen
P. Finzer, U. Soto, K. Hacke, A. Csernok, F. Rösl.
Kooperationen: Barrett Rollins, Harvard University, Boston, USA
Weiterhin wurde die Regulation des MCP-1 Gens (“Monozyten-Chemotaktisches-Protein”)
in Zervixkarzinomzellen
und davon abgeleiteten nicht-malignen somatischen Zellhybriden
untersucht. MCP-1 ist ein Chemokin (=Chemotaktisches
Zytokin), das an der Infiltration und Aktivierung
von Zytokin-sezernierenden Makrophagen in Geweben beteiligt
ist. Wie bereits früher gezeigt (Rösl et al., 1994;
Journal of Virology 68: 2142-2150), wird das MCP-1 Gen in
Zervixkarzinomzellen nicht exprimiert und kann auch durch
Zytokine wie TNF-α nicht mehr induziert werden. Anderseits
sind beide Eigenschaften nach der Fusion mit normalen
humanen Zellen wieder rekonstituierbar. Es ist daher zu
vermuten, dass der Verlust der MCP-1 Expression bzw. eine
Dysregulation von Chemokinen allgemein, einen Selektionsvorteil
darstellt, wodurch sich HPV-positive Zellen einer lokalen,
durch Zytokine vermittelten Wachstumskontrolle entziehen.
Daher besteht ein alternativer und vielversprechender
therapeutischer Ansatz darin, die Re-expression des
MCP-1 Gens direkt in Tumorzellen anzustreben. Aufgrund
unserer Vorversuche wurde inzwischen eine präklinischen
Studie am DKFZ initiiert, wobei Adeno-Assoziierte-Viren Typ
2 (AAV-2) als Transfer-Vektoren für MCP-1 verwendet wurden.
Der Gentransfer ex vivo in Zervixkarzinomzellen führte
hierbei in der Tat im Versuchstier zu einer deutlichen Hemmung
der Tumorbildung (Kunke et al., 2000; Cancer Gene
Therapy 7: 766–777). Damit rückte zwangsläufig die Frage
in den Vordergrund, welche Regulationsmechanismen in
HPV-positiven Zellen die Ursachen dafür bilden, dass MCP-
1 im Laufe der Mehr-Stufen-Karzinogenese abgeschaltet
wird. Dieses Problem konnte ebenfalls abgeklärt werden:
MCP-1 wird über eine 3´-regulatorische Kontrollregion reguliert
wird, die in tumorigenen Zellen nicht mehr aktiv ist
(Finzer et al., 2000; Oncogene 19: 3235-3244). Im Rahmen
einer Kooperation mit Barrett Rollins konnten wir kürzlich
zeigen, dass MCP-1 schon sehr früh (d. h. bereits während
der Immortalisierung durch HPV) selektiv abgeschaltet wird
[3].
Ad 2b) Regulation der Interferon Expression in
HPV-positiven Zellen
A. Bachmann, T. Ritter, R. Zawatzky, U. Soto, F. Rösl
Neben MCP-1 kann TNF-α auch Interferon-β (IFN-β) induzieren.
Die Produktion von IFN-β ist die schnellste Immunantwort
die vom Wirt gegen virale Infektionen aktiviert
werden kann. So konnten wir aufzeigen, dass die Konversion
vom prämalignen zum malignen Phänotyp auch durch
die Eigenschaft gekennzeichnet ist, in geeigneter Weise
IFN-β zu produzieren. Ähnlich wie im Falle von MCP-1, kann
TNF-α das IFN-β Gen wiederum nur in nicht-malignen Zel-