MDCK-MRP2 - Dkfz

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Forschungsschwerpunkt B
Funktionelle und Strukturelle Genomforschung
ginnend mit der Herstellung von cDNA-Ressourcen, bis zur
detaillierten funktionellen Charakterisierung der kodierten
Proteine reicht [39,40].
Das Deutsche cDNA Konsortium, das von der Abteilung
Molekulare Genomanalyse (MGA) koordiniert wird, wurde
1996 im Rahmen des Deutschen Humangenomprojekts
(DHGP) gegründet, als zweites Hochdurchsatz-cDNA-Projekt
weltweit [Genome Res 11(2001) 422-435]. Ziel des
Konsortiums ist, neue Gene zu identifizieren und Volle-Länge
cDNA Klone für die Funktionsanalyse bereitzustellen. Im
NGFN konnte dieses Projekt 2001 erweitert werden und
ist damit eines von gegenwärtig drei großen derartigen
Projekten (neben jeweils einem Projekt in Japan und den
USA).
Bis Ende 2003 hatte die Abteilung Molekulare Genomanalyse
1.516 cDNAs in dieser Kooperation sequenziert, was einer
Länge von über 5,1 Mega Basen entspricht. Das gesamte
Konsortium hatte zu diesem Zeitpunkt über 12.000 cDNAs
mit zusammen 39,2 Mega Basen sequenziert. Die Annotation
der cDNAs wird an der GSF (München) durchgeführt,
die Sequenzen werden in die EMBL/GenBank/DDBJ Datenbanken
eingegeben. Die cDNA-Klone stehen über das RZPD
(Deutsches Ressourcen Zentrum für Genomforschung
GmbH) Wissenschaftlern in aller Welt zur Verfügung.
II. 2. 1 Automatisierte Lokalisation der von FLcDNA
kodierten Proteine
S. Bechtel, A. Duda, K. Hettler, S. Wiemann
In Zusammenarbeit mit: R. Pepperkok, J. Simpson (EMBL, Heidelberg)
Zu den wesentlichen Herausforderungen der großen Genomprojekte
gehören die beträchtlichen Datenmengen,
die weltweit generiert werden. Eine essentielle Aufgabe
besteht darin, diese Daten mit krankheitsorientierten und
funktionellen Informationen zu assoziieren. Entscheidend
für die Funktionalität eines Genproduktes ist seine zelluläre
Lokalisation.
Um diese zu untersuchen nutzen wir die Ressource des
Deutschen cDNA Konsortiums an Volle-Länge-cDNA zunächst
zur systematischen Klonierung der offenen Leserahmen
(ORFs). In Folgeexperimenten verknüpfen wir die kodierten
Proteine mit dem Lokalisationsmarker „Green fluorescent
protein“ (GFP), um ihre subzelluläre Position in lebenden
Zellen zu detektieren [EMBO Rep 1 (2000) 287-
292]. Da wir das GFP einerseits am N-Terminus, andererseits
aber in separaten Konstrukten auch am C-Terminus coexprimieren,
können wir eindeutige Aussagen über die
korrekte Lokalisation machen und des Weiteren die Konstrukte
identifizieren, die diese korrekte Lokalisation erreichen.
Diese Information ist wesentlich für die Planung und
Analyse weiterführender funktioneller Untersuchungen der
Expressionskonstrukte.
Bisher wurden über 650 Proteine subzellulär lokalisiert, die
Informationen, zusammen mit lichtmikroskopischen Aufnahmen
sind in der LIFEdb Datenbank [41] öffentlich zugänglich
(www.dkfz.de/LIFEdb).
Abteilung B050
Molekulare Genomanalyse
II. 3 Zell-basierte Hochdurchsatz-Assays zur
Funktionsanalyse neuer Proteine
D. Arlt, L. Bergman, M. Sabbela, M. Majety, R. Albert,
R. Wellenreuther, C. Schmidt, H. Wilhelm, W. Huber,
S. Wiemann, A. Poustka
In Zusammenarbeit mit: R. Pepperkok, U. Liebel (EMBL, Heidelberg);
P. Bastiaens, H. Erfle (EMBL, Heidelberg)
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
Während die Zahl der bekannten Gene insbesondere durch
Hochdurchsatz-cDNA-Projekte in den vergangenen Jahren
stark gestiegen ist, liegen Funktion und Krankheitsrelevanz
für die Mehrheit der kodierten Proteine weiter im Dunkeln.
Die Verfügbarkeit einer großen Zahl von Volle-Länge-cDNAs
bietet die Möglichkeit, systematische Analysen durchzuführen.
Ein hoher Automatisierungsgrad der Analyse ist erforderlich,
um aus der großen Zahl neuer Gene und Proteine insbesondere
die krankheitsrelevanten herauszufiltern. Wir haben
daher verschiedene Hochdurchsatz-Assays etabliert, die die
Funktion der Proteine im zellulären Umfeld beleuchten.
Unser Focus liegt insbesondere auf krebsrelevanten Eigenschaften
dieser Proteine, wie der Funktion in Zellproliferation,
Apoptose, MAPKinase Signalwegen und Calcium Signalwegen.
In den Assays wird die Funktion der Proteine sowohl durch
Überexpression, mit Hilfe der ORF-GFP Expressionskonstrukte,
als auch durch „Unterexpression“, mittels RNA-
Interferenz (RNAi), untersucht. Demzufolge erhalten wir
sich ergänzende Informationen, die ein umfassendes Bild
entstehen lassen. Zur Analyse setzen wir ein automatisches
Screening-Mikroskop ein, das von einem Kooperationspartner
(R. Pepperkok, EMBL) in einem gemeinsamen Projekt
entwickelt wird. Insbesondere verwenden wir FACS-Geräte,
denen zwar die räumliche Auflösung eines Mikroskops fehlt,
die aber einen höheren Durchsatz erreichen - und mit größeren
analysierten Zellzahlen eine erhöhte statistische Absicherung
der Resultate ermöglichen. Im Verlauf des Projekts
wurden statistische Methoden etabliert, die sich als essentiell
für eine gesicherte Analyse der Assays erwiesen haben
(s.II.5). Weitere Assays befinden sich im Aufbau.
II. 4 Proteomik
U. Korf, B. Guilleaume, F. Klimek, R. Will, S. Schleeger,
R. Zahn, E. Backes, W. Huber, S. Wiemann, A. Poustka
In Zusammenarbeit mit: M. Schnölzer, B. Ueberle, S.
Wandschneider (V250), G. Moldenhauer (D050), D. Bossemeyer
(A060), (alle DKFZ); G. Tovar (Fraunhofer Institut Stuttgart); K.
Büssow, A. Diehl (Proteinstrukturfabrik Berlin); R. Pepperkok, T.
Sardon, I. Vernos (EMBL Heidelberg), P. Drückes (Proqinase,
Freiburg)
II. 4. 1 Protein-Expression (E. coli und Baculovirus)
Rekombinante Proteine stellen die Ausgangsbasis für eine
Vielzahl von experimentellen Ansätzen in der Proteinchemie
dar, wie die Produktion von Antikörpern, die strukturelle
Charakterisierung und die Herstellung von Protein-Arrays.
Auf Basis der im Deutschen cDNA Konsortium identifizierten
und im Projekt zur subzellulären Lokalisation getesteten
ORFs unbekannter Funktion werden mit Hilfe des Gateway-
Systems (Invitrogen) Expressionsvektoren transferiert. Die
in E. coli und Baculovirus exprimierten Proteine werden
auf Expressionslevel und Löslichkeit geprüft und dann standardmäßig
durch Massenspektrometrie bestätigt. Für die
Proteinexpression in E. coli ist das Verfahren bereits weitgehend
automatisiert worden. Für präparative Zwecke können
Proteine auch im mg-Maßstab hergestellt werden.