MDCK-MRP2 - Dkfz

Forschungsschwerpunkt C
Krebsrisikofaktoren und Krebsprävention
prozesse zu deren Beseitigung auf. Deshalb wurde die Fähigkeit
bestrahlter Zellen zur DNA-Reparatur und die Expression
der daran beteiligten Gene untersucht. Als mögliche zelluläre
Biomarker für Strahlensensitivität wurden im Comet Assay
DNA-Hintergrundschaden, induzierter DNA-Schaden nach
in vitro γ-Bestrahlung mit 5 Gy sowie die anschließende
DNA-Reparaturkapazität nach 15 und 60 min evaluiert. Zusätzlich
wurden zur Identifizierung potentieller Marker-Gene
Expressionsanalysen für ausgewählte Patienten durchgeführt,
d. h. mittels cDNA-Arrays, die ca. 130 an der DNA-
Reparatur beteiligte Gene umfassten, und quantitativer RT-
PCR wurden sog. Expressionsprofile erstellt (siehe Punkt
2).
In die Studie mit Brustkrebspatientinnen wurden solche
Patientinnen aufgenommen, die nach einer brusterhaltenden
Operation eine therapeutische Strahlenbehandlung
erhielten [5, 12]. Als Anzeichen klinischer Strahlensensitivität
wurde das Auftreten unerwünschter Nebenreaktionen der
Haut im Bestrahlungsfeld erfasst. Zur Bestimmung der DNA-
Reparaturkapazität in vitro wurden periphere Lymphozyten
von 113 Patientinnen mit einer Dosis von 5 Gy γ-Strahlen
behandelt und mit dem alkalischen Comet-Assay untersucht.
Die Reproduzierbarkeit des Assays wurde durch
die wiederholte Bestimmung (n=26) der Reparaturaktivität
von Lymphozyten eines gesunden Referenzspenders bestimmt,
wobei ein Variationskoeffizient von 0.3 errechnet
wurde. Die ermittelten Reparaturparameter (s.o.) zeigten
für die Zellen der Patientinnen deutlich größere Schwankungen
als für die der Referenzperson. Im einzelnen wurden
11 Patientinnen mit einer deutlich erhöhten DNA-Schädigung
nach γ-Bestrahlung sowie 7 Patientinnen mit stark
erniedrigter Reparaturkapazität nach 15 und 30 min gefunden.
In der Klinik wurden sechs Patientinnen als besonders
strahlenempfindlich eingestuft, da sie nach einer
Gesamtdosis von 50 Gy eine feuchte Desquamation der
Haut im Bestrahlungsfeld aufwiesen. Der Vergleich der beiden
Gruppen von Patientinnen, die im Experiment oder in
der Klinik strahlenüberempfindlich waren, zeigte allerdings
nur eine geringe Übereinstimmung. Dies gilt auch dann,
wenn für den Vergleich diejenigen Nebenwirkungen erfasst
werden, die bei den Patientinnen über den gesamten Therapie-
und Beobachtungszeitraum auftraten. Zusammenfassend
kann daher gesagt werden, dass mit Hilfe des alkalischen
Comet Assays Patientinnen identifiziert werden
können, die eine gestörte Fähigkeit zur Reparatur strahleninduzierter
DNA-Schäden aufweisen. Diese Reparatur-Störungen
spiegeln allerdings nur in sehr geringem Umfang
die klinische Strahlenempfindlichkeit der Haut der Patientinnen
wieder. Mögliche Ursachen dafür könnten zum einen
darin bestehen, dass der Comet Assay nicht die für die
erfassten Nebenwirkungen repräsentativen Reparaturparameter
misst, zum anderen aber auch darin, dass die
bei den Brustkrebspatientinnen beobachteten akuten Nebenwirkungen
durch andere Mechanismen, wie Entzündungsreaktionen
der Haut, bedingt sind. Daher werden
zur Zeit klinische Spätfolgen der Therapie sowie zusätzliche
experimentelle Reparaturparameter, wie die Expression bestimmter
Reparaturgene, für die Patientinnen erfasst.
In einer weiteren Studie mit Prostatakarzinom-Patienten
wird eine weiter entwickelte Version des Comet Assays
eingesetzt. Unter anderem konnte die experimentelle Variabilität
durch Einbeziehen eines Standards bei jedem Experiment
besser kontrolliert werden. Zusätzlich findet man
bei den Prostatakarzinom-Patienten ein sehr viel breiteres
Spektrum an Nebenwirkungen (u. a. sind durch die Bestrah-
Abteilung C010
Toxikologie und Krebsrisikofaktoren
lung benachbarte Organe wie Blase und Darm betroffen),
so dass eine differenziertere Einstufung der Nebenwirkungen
möglich ist. Die Comet Assay-Untersuchungen wurden
bisher für 195 Patientenproben abgeschlossen. Dabei wurden
wiederum Proben mit Störungen in den DNA-Reparaturparametern
identifiziert; einige Proben zeigten ihre erhöhte
zelluläre Strahlensensitivität bei mehr als einem der Comet
Assay-Parameter. In einem Subkollektiv von Patienten,
die auf die Therapie entweder unauffällig oder aber mit
schweren Nebenwirkungen reagiert haben, wurde eine
erste Datenanalyse durchgeführt. Die klinischen und epidemiologischen
Patientendaten ergaben für 40 Patienten
(67.8%) des Subkollektivs keine erhöhte Strahlensensitivität
während 19 Patienten (32.2%) klinisch deutlich strahlensensitiv
waren. Der Vergleich der Comet Assay-Daten mit
diesen klinischen Befunden zeigte, dass eine Korrelation
der Empfindlichkeitswerte erkennbar ist: z. B. hatten nur
12.5 % der nicht klinisch empfindlichen aber 26.3 % der
empfindlichen Patienten eine Auffälligkeit im Comet Assay.
Die bisherige Auswertung der Daten hat gezeigt, dass der
Comet Assay geeignete biologische Endpunkte charakterisiert,
die als potentielle Biomarker für klinische Strahlensensitivität
genutzt werden können.
2. Expressionsprofile von DNA-Reparaturgenen
P. Schmezer, C. Mayer, J. Hümmerich, G. Werle-
Schneider, K. Frerk, O. Zelezny, P. Waas, O. Popanda
In Zusammenarbeit mit W. Rittgen, A. Benner, L. Edler,
Biostatistik, DKFZ; A. Bach, M.C. von Brevern, Axaron Bioscience
AG, Heidelberg.
Gefördert vom Bundesamt für Strahlenschutz, Salzgitter.
Es ist ein wichtiges Ziel der Arbeitsgruppe, solche DNA-
Reparaturgene zu identifizieren und zu charakterisieren, die
für Störungen der zellulären DNA-Reparaturfähigkeit (z.B.
ermittelt durch Comet Assay) verantwortlich sein können.
Dazu untersuchen wir die Expression verschiedener menschlicher
Reparaturgene auf der mRNA-Ebene. Wir entwickelten
cDNA-Arrays, mit deren Hilfe die Expression von ca.
130 Genen, die bei der Reparatur von DNA-Schäden eine
Rolle spielen, gleichzeitig gemessen werden kann. Aus
IMAGE cDNA-Klonen isolierten wir für jedes dieser Gene
repräsentative PCR-Fragmente. Nach Verifizierung der Identität
der PCR-Fragmente durch Sequenzanalyse wurden
diese Fragmente auf Membranen gespottet und fixiert.
Mit Hilfe dieser Arrays wurde zunächst untersucht, ob sich
das Expressionsmuster von DNA-Reparaturgenen in ruhenden
peripheren menschlichen Blutlymphozyten von dem
in Mitogen-stimulierten (mit PHA behandelten) Zellen unterscheidet
[1]. Es gibt Hinweise, dass die Fähigkeit der Zellen,
DNA-Schäden zu reparieren, mit ihrer Proliferationsaktivität
zusammenhängen könnte. Es ist deshalb eine wichtige Frage
für molekular-epidemiologische Studien, ob stimulierte
oder ruhende Lymphozyten zur Messung der DNA-Reparaturkapazität
eingesetzt werden sollen. Es wurden Hybridisierungsexperimente
sowohl mit ruhenden als auch mit bis
zu 72 Stunden mit PHA- stimulierten Lymphozyten durchgeführt.
Wir haben 12 Gene identifiziert, die 72 Stunden
nach PHA-Behandlung mit einem mehr als zweifachen Anstieg
der Transkriptmenge reagierten, wobei der maximale
Anstieg mehr als das Achtzehnfache betrug. Für die meisten
der hochregulierten Reparaturgene ist bekannt, dass
sie außer bei der DNA-Reparatur auch eine Rolle bei der
DNA-Replikation spielen. Im Gegensatz hierzu beobachteten
wir bei 74% der Reparaturgene keinen Anstieg des
Expressionsniveaus, d.h. die Messwerte lagen innerhalb eines
DKFZ 2004: Wissenschaftlicher Ergebnisbericht 2002 - 2003
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