APPUNTI DI SEMEIOTICA - Istituto Comprensivo "G. Palatucci"

Giordano Perin; medicina di laboratorio 4: il fegato
CONTENENTI UNICAMENTE LE REGIONI DI INTERESSE.
al TERZO CICLO il livello di DOPPI FILAMENTI UTILI comincia ad incrementare in
modo considerevole.
Si procede fintanto che si ritiene necessario; è importante ricordare però che l'efficienza della
reazione non è sempre del 100%, oltre i 35-40 cicli la reazione perde in efficienza fino praticamente
a fermarsi.
Il test in questione presenta in ogni caso una SPECIFICITÀ ESTREMAMENTE ELEVATA.
LA PCR è molto utilizzata in laboratorio per esempio:
• nella ricerca delle CALMYDIE: si tratta di parassiti intracellulari difficilmente coltivabili
• nella ricerca di moltissimi patogeni virali.
Per questo tipo di patogeni il DNA risulta facilmente estraibile e di conseguenza la diagnosi risulta
molto facilitata.
APPLICAZIONI DELLA PCR ALL'HCV:
i test disponibili nella valutazione della presenza dell'HCV sono tre:
QUALITATIVO che consente di determinare se è presente o meno il virus.
QUANTITATIVO che consente di determinare quanto virus è presente
GENOTIPIZZAZIONE che consente di identificare lo specifico isotipo presente.
IDENTIFICAZIONE QUALITATIVA:
anzitutto L'RNA deve essere TRASFORMATO IN cDNA, questo è reso possibile grazie alla azione
della TRASCRITTASI INVERSA, enzima tipico del virus dell'HIV. Nello specifico:
si ricava l'RNA VIRALE.
Si pone il campione in contatto con un primer:
SPECIFICO: nella amplificazione dell'RNA messaggero cellulare si utilizza un primer
che si associa alla coda di poli A caratteristica di queste molecole, nel caso specifico
questo non è possibile in quanto l'RNA in questione non lo presenta.
UN POOL DI NUCLEOTIDI: vengono inserite sequenze di primers di piccole
dimensioni DI MODO CHE SIANO PRESENTI NEL CAMPIONE TUTTE LE
COMBINAZIONI POSSIBILI, in questo modo la componente maggiormente affine si
assocerà al campione denaturato.
questa reazione si esegue a circa 37-42° a seconda del tipo di POLIMERASI UTILIZZATA.
si preleva il DNA neoformato e lo si pone in un altro ambiente di reazione.
Per semplificare l'intero processo è stato recentemente ingegnerizzato un enzima che:
A 37° funziona come trascrittasi inversa.
A 72° funziona come DNA POLIMERASI.
In questo modo è possibile lavorare su un'unica provetta, è sufficiente variare la temperatura di
lavoro. Una volta amplificato il frammento virale:
• il DNA viene colorato generalmente con ETIDIO BROMURO che, come accennato, è un
chelante fosforescente.
• si fa scorrere il campione su un gel polarizzando delle piastre.
• I polimeri di acido nucleico si muovono lungo il gel sulla base delle loro dimensioni e della
loro carica, sempre negativa.
• Possiamo a questo punto VALUTARE LA LUNGHEZZA DEL FRAMMENTO
PRODOTTO CON LA POLIMERIZZAZIONE.
Per questo tipo di test DEVE SEMPRE ESSERE ESEGUITO UN CAMPIONE DI CONTROLLO
NEGATIVO privo dei substrati virali: questo è fondamentale per evitare FENOMENI DI
CONTAMINAZIONE AMBIENTALE. Soprattutto nel momento in cui si eseguano analisi uguali
tra loro, per un medesimo patogeno, frammenti di DNA possono formare delle aerosol che possono,
durante le operazioni, contaminare il campione. Per ovviare a questo problema spesso si lavora per i
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