APPUNTI DI SEMEIOTICA - Istituto Comprensivo "G. Palatucci"

Giordano Perin; medicina di laboratorio 4: il fegato
processi di purificazione di moltiplicazione in due stanze differenti. Il processo di moltiplicazione
del genoma dura anche 2-3 ore.
IDENTIFICAZIONE QUANTITATIVA:
il test relativo alla PCR sopra descritto non ci consente di determinare in senso QUANTITATIVO
quanto materiale presente inizialmente è stato amplificato: l'andamento della reazione prevede la
presenza di una fase di salita breve, di incremento notevole, lineare quasi logaritmico, fino al
plateau finale. Per poter conoscere con precisione la QUANTITÀ di DNA presente inizialmente è
stato necessario inventare una nuova applicazione detta PCR REALTIME che:
amplifica il DNA.
è capace di rilevare la fluorescenza generata dal DNA in fase di formazione, in tempo reale.
la reazione è simile alla precedente dal punto di vista pratico:
anzitutto si inseriscono i materiali necessari ad eseguire la amplificazione tramite PCR.
Si inseriscono nel campione delle sonde, si tratta di sequenze di basi:
di lunghezza limitata, molto corte.
compatibili con una regione intermedia al DNA in fase di amplificazione.
Con associate due molecole:
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una molecola CHE EMETTE FLUORESCENZA o reporter.
una molecola CHE ASSORBE LA FLUORESCENZA emessa dalla prima detta
quancer.
Si parla di sonde TaqMan o di idrolisi.
quando si innesca il processo di polimerizzazione, la DNA POLIMERASI rimuove i segmenti di
DNA che incontra sulla sua strada man mano che procede, di conseguenza:
si separano tra loro gli elementi FLUORESCENTE e ASSORBENTE.
la fluorescenza aumenta IN MODO DIRETTAMENTE PROPORZIONALE ALLA
QUANTITÀ DI DNA SINTETIZZATO.
Possiamo quindi ovviamente dire che MAGGIORE È LA QUANTITÀ DI DNA PRESENTE NEL
CAMPIONE, MENO TEMPO È NECESSARIO PERCHÉ LA FLUORESCENZA PRODOTTA
DIVENGA VISIBILE.
L'ANDAMENTO DELLA CURVA:
come accennato inizialmente, l'andamento della curva è tipicamente SIGMOIDE, e sulla base della
inclinazione dalla curva stessa nei diversi punti, possiamo identificare UN TERMINE DI
EFFICIENZA compreso tra 0 e 1 per cui:
inizialmente la reazione è lenta e presenta un'efficienza relativamente bassa.
La reazione diviene esponenziale e l'efficienza si avvicina a 1 seppur senza raggiungerlo.
Infine la fase di pleteau durante la quale l'efficienza è fondamentalmente prossima allo 0.
Più la reazione procede, più aumenta la fluorescenza percepita:
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