APPUNTI DI SEMEIOTICA - Istituto Comprensivo "G. Palatucci"

Giordano Perin; medicina di laboratorio 4: il fegato
inizialmente la macchina percepisce una radiazione di fondo, non ben distinta.
con il procedere della reazione la fluorescenza aumenta in intensità.
la fluorescenza diviene infine chiaramente visibile alla macchina.
La attività della macchina è quella di INDICARE A QUALE CICLO DI MOLTIPLICAZIONE IL
DNA È STATO SUFFICIENTEMENTE AMPLIFICATO da RISULTARE VISIBILE, PRIMA
DIVIENE VISIBILE IL CAMPIONE, infatti, PIÙ MOLECOLE ERANO PRESENTI
INIZIALMENTE, è a questo punto facile risalire alle concentrazioni di DNA presenti all'inizio.
Grafici ricavati dallo studio di una serie di
campioni in PCR realtime: le diverse
curve presentano tutte andamento
sigmoide anche se con conformazione
lievemente differente una dall'altra. Per
tutte le curve il livello di fluorescenza
iniziale è il medesimo, con il tempo la
fluorescenza va aumentando in maniera
più o meno consistente a seconda della
quantità di DNA inizialmente presente.
immagine tratta da wikipedia
VALUTAZIONE DELLA ATTIVITÀ VIRALE:
come accennato in precedenza possiamo determinare due aspetti della attività virale nell'organismo:
se utilizziamo un PRIMER COMPATIBILE CON L'RNA POSITIVO nei processi relativi
alla PCR REVERSE TRANSCRIPTION, possiamo identificare IL NUMERO TOTALE
DELLE COPIE DEL VIRUS presenti nel campione.
se utilizziamo un PRIMER COMPATIBILE CON L'RNA NEGATIVO nei processi relativi
alla PCR REVERSE TRANSCRIPTION possiamo identificare IL NUMERO DELLE
COPIE ATTIVAMENTE GENERATE DAL VIRUS.
A seconda del diverso obiettivo quindi, si possono eseguire analisi differenti, in linea generale in
clinica si richiede il dosaggio dell'RNA totale. Ricordiamo per quanto riguarda questa tecnica che:
• il processo è breve, riduce il tempo operativo da ore a minuti.
• Presenta dei costi molto elevati: una sonda per ogni set di amplificazione, costa anche 500
euro.
IDENTIFICAZIONE DEL GENOTIPO VIRALE:
si utilizza in questo caso UNA TECNICA DIFFERENTE, si parla di DOT BLOT.
Fondamentalmente:
si preleva IL CAMPIONE e lo si divide in 10 parti.
Si amplifica IL CAMPIONE.
Si analizza il campione:
si inseriscono degli oligonucleotidi specificamente compatibili con le diverse sequenze
di DNA derivato dalla amplificazione dell'RNA virale ANCORATE ALLA
SUPERFICIE DEL CONTENITORE, questo per tutti e 10 i genotipi possibili su 10
contenitori differenti.
si inserisce il campione di DNA AMPLIFICATO.
IDENTIFICAZIONE:
generalmente si esegue TRAMITE FLUOROCROMI:
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