Volumen II - SAM

2.1-Microorganismos y condiciones de cultivo
Lactobacillus curvatus CRL705, productor de lactocina 705 y lactocina AL705, y Lactobacillus plantarum
CRL691, usado como cepa sensible frente a lactocina 705, fueron cultivados a 30°C en caldo MRS (Britania,
Argentina). Listeria innocua 7, cepa indicadora de lactocina AL705 fue cultivada a 30°C en caldo trypticase
soy broth (TSB; BBL, Cockeysville, MD) adicionado con 0.5% de extracto de levadura. Antes de ser usadas,
todas las cepas se almacenaron a -20°C en 15% de glicerol.
2.2-Purificación de las bacteriocinas producidas por Lactobacillus curvatus CRL705
Lactocina 705 y lactocina AL705 se purificaron siguiendo los pasos llevados a cabo por Blanco Massani y
col. [1]. Brevemente, un sobrenadante libre de células de un cultivo overnight de L. curvatus CRL705
inoculado al 1% fue precipitado con sulfato de amonio al 44% agitando durante 12 horas y centrifugado a
10000 rpm durante 20 minutos. El sólido precipitado obtenido fue liofilizado, resuspendido en agua y
utilizado como solución acuosa de bacteriocinas parcialmente purificadas (SABPP).
2.3-Obtención y estabilidad de la película activa de PE
Para obtener la película activa de PE se siguió el protocolo desarrollado por Blanco Massani y col. [1].
Brevemente, una película de multicapa de PE se hizo flotar sobre la SABPP en concentración de 0,1%,
durante 1 hora a 30ºC. Luego de la activación, la película se lavó con agua destilada estéril y secó durante 10
minutos a 50ºC. Las películas activas obtenidas se almacenaron a 10 y 30ºC, durante 45 días y
periódicamente se determinó su actividad en medio agar semisólido sembrado con las cepas sensibles
(Lactobacillus plantarum CRL691 y Listeria innocua 7). La actividad antimicrobiana se puso en evidencia
por la aparición de un halo de inhibición en la superficie agarizada y se expresó como área de inhibición
relativa (área de inhibición/área de la película).
2.4-Estabilidad y rendimiento de la solución activa
Para estudiar la estabilidad antimicrobiana de la solución de activación SABPP 0.1% en función del tiempo,
se determinó el título de la misma, mediante el método de difusión en agar [2], cada 4 meses y por un
período de almacenamiento de 2 años a -20°C. El rendimiento de la SABPP se determinó utilizando 1 ml de
la misma para realizar varias activaciones sucesivas de películas de PE de 4.26 cm 2 . Se evaluó la actividad de
las películas tratadas frente a las cepas sensibles.
2.5-Propiedades de sellado y ángulo de contacto
Se determinó la fuerza de sellado en la película activa y un control según norma ASTM F88-06 [3]. Los
ensayos se realizaron a 20ºC y 50% de humedad relativa. La velocidad de separación de mordazas fue de 200
mm/minutos, con una distancia inicial de 25 mm. Para obtener las muestras termoselladas se ulitizó una
máquina termoselladora (TP-701S Heat Seal Tester, Tokyo, Japan). Las condiciones de termosellado fueron
de 150°C, 1 seg, 2,5 Pa, tanto para la película tratada con bacteriocinas como para el control sin tratar.
El ángulo de contacto de las películas se determinó colocando sobre su superficie 20 µl de agua bidestilada y
tomando fotos utilizando una cámara Nikon Coolpix 950 - 2.11 Magapíxel - Zoom Óptico 3x. Se midió el
ángulo de contacto mediante el Software:Surftens 3.0. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado.
2.6-Migración de lactocina 705 y lactocina AL705
El estudio de migración de las bacteriocinas producidas por L. curvatus CRL705 desde la película activa, se
realizó siguiendo los lineamientos de la legislación vigente para artículos plásticos en contacto con alimentos
en conservación durante tiempos prolongados [4]; se utilizó agua como simulante de alimento y el ensayo se
llevó a cabo a 5ºC durante 15 días. Con el fin de obtener una concentración de analito más favorable para el
análisis, se utilizó una relación de área de material plástico/volumen de simulante de 2.83 cm 2 /ml, la cual es
mayor que la establecida por la norma vigente. Se determinó el área de inhibición relativa de la película que
se puso en contacto con el simulante y la película activa almacenada a 5ºC durante todo el período de ensayo
(Control positivo). Para detectar la presencia de bacteriocinas en el simulante acuoso se utilizó el método de
difusión en agar
.2.7-Adsorción de lactocina 705 sintética en la superficie de PE. Estudios cinéticos y de equilibrio.
Lactocina 705 sintética [5,6] se prepararó a partir de una relacion 1:4 de Lac705α:lac705β [7].
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