VOLUMEN I

no liofilizado. La equivalencia en Unidades Internacionales
del Patrón Internacional la establece la
Organización Mundial de la Salud.
El método cromogénico consta de dos pasos
consecutivos: la activación del factor VII a factor
VIIa, por medio del factor tisular y calcio, la activación
de factor X a factor Xa por la presencia de
factor VIIa, calcio fosfolípidos y factor tisular y el
Etapa 1:
segundo paso es el clivaje enzimático de un sustrato
cromogénico específico para el factor Xa, para dar
un cromóforo que se puede cuantificar espectrofotométricamente.
En las condiciones adecuadas,
existe una relación lineal entre la velocidad de formación
del factor Xa y la concentración del factor
VII. El ensayo se resume en el siguiente esquema:
2+
Factor tisular + Ca
a) Factor VII Factor VIIa
⎯⎯⎯⎯⎯⎯→
b) Factor X
2
Factor VIIa + Ca
+ Factor tisular/ fosfolípidos
Factor Xa
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→
Etapa 2:
Sustrato cromogénico
Factor Xa
⎯⎯⎯⎯→Péptido + cromóforo
En ambas etapas se utilizan reactivos que pueden
ser obtenidos comercialmente. La composición
de cada reactivo puede estar sujeta a alguna variación,
sus características esenciales se describen en
las siguientes especificaciones: los reactivos contienen
proteínas purificadas de origen humano o bovino.
Éstas incluyen factor X, factor tisular y fosfolípidos
como activador del factor VII. Estas proteínas
están parcialmente purificadas y no deben contener
impurezas que interfieran en la activación del
factor VII o del factor X. El factor X está presente
en cantidades cuya concentración final durante el
primer paso del ensayo esta comprendida entre 10 y
350 nmol por litro (preferentemente de 14 a
70 nmol por litro). Tromboplastina de origen natural
(cerebro bovino o de conejo) o de origen sintético,
se puede usar como fuente de factor tisular y
fosfolípidos. La Tromboplastina adecuada para uso
en la determinación del tiempo de protrombina se
diluye entre 1 en 5 y 1 en 50 en una solución reguladora
tal que la concentración final de Ca 2+ este
comprendida entre 15 y 25 nmol por litro. La formación
final de factor Xa es realizada en una solución
que contiene albúmina humana o bovina con
una concentración tal que no se produzca pérdida
por adsorción y que está apropiadamente regulada a
pH entre 7,3 y 8,0. En la mezcla de incubación
final, el factor VII debe ser el único componente
limitante de la velocidad y cada componente del
reactivo no debe tener capacidad de generar el factor
Xa por sí mismo.
La segunda etapa comprende la cuantificación
del factor Xa por medio de un sustrato cromogénico
específico para el factor Xa. Este sustrato generalmente
consiste de un péptido corto que tiene entre 3
y 5 aminoácidos, unido a un grupo cromóforo.
Cuando se cliva este grupo del péptido sustrato, se
produce un cambio de absorbancia a una longitud
de onda apropiada que permite su cuantificación
espectrofotométrica. El sustrato se disuelve normalmente
en agua y se utiliza a una concentración
final entre 0,2 y 2 mmol por litro. El sustrato puede
contener también inhibidores para detener la formación
adicional de factor Xa (adición de edetato).
Preparación estándar - Reconstituir el contenido
completo de una ampolla de la preparación con
el agregado de una cantidad apropiada de agua;
emplear las preparaciones reconstituidas dentro de
la hora de su preparación. Realizar una dilución
con suficiente prediluyente para obtener una solución
que contenga entre 0,5 UI y 2,0 UI de factor
VII por mililitro. Preparar las diluciones posteriores
empleando una solución reguladora isotónica y
no quelante que contenga 1 % de albúmina humana
o bovina, regulada entre pH 7,3 y 8,0. Preparar
preferentemente por duplicado y en forma independiente
por lo menos tres diluciones en progresión
geométrica o aritmética. Las diluciones deben
prepararse de forma tal que la concentración final
de factor VII esté por debajo de 0,005 UI por ml.
Preparación muestra - Reconstituir el contenido
completo de la ampolla según se indica en el
rótulo. Emplear las preparaciones reconstituidas
dentro de la hora de su preparación. Hacer una
dilución con suficiente prediluyente para obtener
una solución que contenga entre 0,5 UI y 2,0 UI de
factor VII por mililitro. Preparar las diluciones
posteriores empleando una solución reguladora
isotónica y no quelante que contenga 1 % de albúmina
humana o bovina, regulada entre pH 7,3 y 8,0.
Preparar preferentemente por duplicado y en forma
independiente por lo menos tres diluciones en progresión
geométrica o aritmética. Las diluciones
deben prepararse de forma tal que la concentración
final de factor VII esté por debajo de 0,005 UI/ml.
Procedimiento - Preparar una solución control
que incluya todos los componentes exceptuando el
factor VII (blanco).