VOLUMEN I

Proteínas totales
Diluir la preparación a examinar, si fuera
necesario, con una solución de cloruro de sodio 9 g
por litro para obtener una solución de
aproximadamente 15 mg de proteína en 2 ml.
Transferir 2,0 ml a un tubo de centrífuga de fondo
redondo y agregar 2,0 ml de una solución de
molibdato de sodio 75 g por litro y 2,0 ml de una
mezcla de agua y ácido sulfúrico libre de nitrógeno
(30:1). Agitar, centrifugar durante 5 minutos,
decantar el sobrenadante líquido y dejar escurrir el
tubo invertido sobre un papel de filtro. Determinar
el contenido de nitrógeno en el residuo (ver
200. Determinación de nitrógeno) y calcular el
contenido de proteínas multiplicando el resultado
por 6,25. [NOTA: si el producto contiene un
estabilizante cuya molécula contiene nitrógeno,
puede utilizarse otro método alternativo validado
para determinación de proteínas.] La preparación
debe contener no menos de 100 g por litro y no más
de 180 g por litro de proteínas y no menos del 90 %
ni más del 110 % por ciento de la cantidad
declarada en el rótulo.
Agua
Determinar el contenido de agua por Titulación
volumétrica directa (ver 120. Determinación de
agua) o según se indica 680. Pérdida por secado.
Debe cumplir con los requisitos establecidos por la
autoridad sanitaria competente.
Composición en proteínas
Examinar por electroforesis de zona (ver 300.
Electroforesis), utilizando como soporte tiras de gel
de acetato de celulosa y como solución de
electrolitos una solución reguladora barbital pH 8,6
(ver Soluciones reguladoras en Reactivos y
Soluciones).
Solución muestra - Diluir la preparación en
ensayo con una solución de cloruro de sodio 9 g por
litro hasta una concentración de proteínas de 50 g
por litro.
Solución estándar - Reconstituir
Inmunoglobulina Humana para
Electroforesis SA-FA y diluir con una solución de
cloruro de sodio 9 g por litro hasta una
concentración de proteínas de 50 g por litro.
Procedimiento - Aplicar sobre una tira 2,5 µl de
la Solución muestra en una banda de 10 mm, o bien
aplicar 0,25 µl por milímetro si se emplea una tira
más estrecha. En otra tira, aplicar en las mismas
condiciones, un volumen igual de Solución
estándar. Aplicar un campo eléctrico tal que el
compuesto que se desplace más rápidamente migre
al menos 30 mm. Tratar las tiras con solución de
negro amido 10B durante 5 minutos y luego
decolorar con una mezcla de metanol y ácido
acético glacial (90:10), hasta que el fondo de las
tiras esté libre de color. Tratar las tiras con una
mezcla de metanol y ácido acético glacial (81:19).
Medir la absorbancia de las bandas a 600 nm
mediante un instrumento capaz de dar a esta
longitud de onda una respuesta lineal para el
intervalo de medida. Calcular el resultado como un
promedio de tres medidas de cada tira. El ensayo
sólo es válido si en el electroforetograma obtenido
con la Solución estándar, la proporción de proteínas
contenidas en la banda principal está dentro de los
límites que se especifican para la sustancia de
referencia. En el electroforetograma obtenido con
la Solución muestra, no más de 10 % de las
proteínas tienen una movilidad distinta de la de la
banda principal.
Distribución del tamaño molecular
Sistema cromatográfico – Emplear un equipo
para cromatografía de líquidos con un detector
ultravioleta ajustado a 280 nm y una columna de
60 cm × 7,5 mm o 30 cm × 7,8 mm con fase
estacionaria constituida por gel de sílice hidrofílico
para cromatografía para fraccionamiento de
proteínas globulares con masa molecular relativa en
el rango de 10.000 a 500.000. El caudal debe ser
aproximadamente 0,5 ml por minuto.
Fase móvil - Disolver 4,873 g de fosfato
dibásico de sodio, 1,741 g de fosfato monobásico de
sodio, 11,688 g de cloruro de sodio y 50 mg de
azida sódica en un litro de agua.
Solución muestra - Diluir la preparación en
ensayo con una solución de cloruro de sodio 9 g por
litro hasta una concentración apropiada al sistema
cromatográfico que se vaya a utilizar.
Solución estándar - Diluir Inmunoglobulina
Humana SR-FA con solución de cloruro de sodio
9 g por litro hasta la misma concentración proteica
que la Solución muestra.
Procedimiento - Inyectar por separado en el
cromatógrafo volúmenes iguales (generalmente el
volumen de inyección debe contener entre 50 a
600 µg de proteínas) de la Solución muestra y la
Solución estándar. Registrar los cromatogramas y
medir las respuestas de todos los picos. En el
cromatograma obtenido con la Solución estándar, el
pico principal corresponde al monómero de IgG
observándose otro pico correspondiente al dímero,
cuyo tiempo de retención relativo es
aproximadamente 0,85 a 0,90 veces el del
monómero. Los picos observados en el
cromatograma obtenido con la Solución muestra se
identifican por comparación con los obtenidos en la
Solución estándar. Cualquier pico con tiempo de