VOLUMEN I

ando como diluyente una solución de 9 g por litro
de cloruro de sodio y albúmina humana 10 a 50 g
por litro. Añadir a cada dilución cantidades adecuadas
de un reactivo von Willebrand conteniendo
plaquetas humanas estabilizadas y ristocetina A.
Mezclar sobre una placa de vidrio con movimientos
circulares durante 1 minuto. Dejar reposar durante
1 minuto y observar sobre fondo oscuro con iluminación
lateral. La última dilución que presenta
aglutinación claramente visible indica el título de
cofactor de ristocetina en la muestra. Emplear el
diluyente como control negativo.
ACTIVIDAD ANTICOMPLEMENTARIA
Llevar a cabo la determinación de la actividad
anticomplemento (AAC) de la inmunoglobulina por
incubación de una determinada cantidad de sustancia
a examinar (10 mg de inmunoglobulina) con una
determinada cantidad de complemento de cobayo
(20 CH 50 ), seguida de la titulación del complemento
residual. Expresar la actividad anticomplemento
como el porcentaje de complemento consumido
respecto al complemento control considerado como
100 %. La unidad hemolítica de actividad del complemento
(CH 50 ) es la cantidad de complemento
que, en las condiciones de la reacción, provoca la
lisis de 2,5 × 10 8 eritrocitos sobre un total de
5 × 10 8 eritrocitos sensibilizados de forma óptima.
Reactivos
Solución concentrada de magnesio y calcio -
Disolver 1,103 g de cloruro de calcio y 5,083 g de
cloruro de magnesio en agua y diluir hasta 25 ml
con el mismo solvente.
Solución reguladora concentrada de barbital -
Disolver 207,5 g de cloruro de sodio y 25,48 g de
barbital sódico en 4 litros de agua y ajustar a pH 7,3
con ácido clorhídrico 1 M. Agregar 12,5 ml de
Solución concentrada de magnesio y calcio y diluir
hasta 5 litros con agua. Filtrar a través de una
membrana filtrante de 0,22 µm y conservar a 4 °C
en envases de vidrio.
Solución de gelatina - Disolver 12,5 g de gelatina
en aproximadamente 800 ml de agua y calentar
a ebullición en un baño de agua. Enfriar a 20 °C y
completar hasta 10 litros con agua. Filtrar a través
de una membrana filtrante de 0,22 µm y conservar a
4 °C. [NOTA: emplear únicamente soluciones
límpidas.]
Solución citratada - Disolver 8,0 g de citrato de
sodio, 4,2 g de cloruro de sodio y 20,5 g de glucosa
en 750 ml de agua. Ajustar a pH 6,1 con una solución
de ácido cítrico 100 g por litro y diluir hasta
1 litro con agua.
Dilución de hemolisi
Solución reguladora gelatina-barbital - Agregar
4 volúmenes de Solución de gelatina a
1 volumen de Solución reguladora concentrada de
barbital y mezclar. Ajustar a pH 7,3, si fuera necesario,
con ácido clorhídrico 1 M o hidróxido de
sodio 1 M y mantener a 4 °C. [NOTA: preparar en
el día de su uso.]
Sangre de carnero estabilizada - Recolectar
1 volumen de sangre de carnero sobre 1 volumen de
Solución citratada y mezclar. Conservar la sangre
estabilizada a 4 °C durante un mínimo de 7 días y
un máximo de 28 días. [NOTA: la sangre de carnero
o los eritrocitos de carnero estabilizados se pueden
obtener comercialmente.]
Hemolisina - Antisuero frente a los eritrocitos
de carnero, preparado en conejo [NOTA: dichos
antisueros se pueden obtener comercialmente.]
Complemento de cobayo - Mezclar los sueros
obtenidos a partir de la sangre de al menos diez
cobayos. Separar el suero de la sangre coagulada
por centrifugación a 4 °C aproximadamente. Conservar
el suero en pequeñas cantidades a una temperatura
inferior a –70 °C.
Método
Preparación de la suspensión patrón de eritrocitos
de carnero al 5 %
Separar los eritrocitos de carnero por centrifugación
de un volumen adecuado de sangre de carnero
estabilizada. Lavar las células tres veces como
mínimo con Solución reguladora gelatina-barbital
y preparar una suspensión al 5 % v/v en Solución
reguladora gelatina-barbital. Determinar la concentración
celular según se indica a continuación.
Agregar 0,2 ml de la suspensión a 2,8 ml de agua y
centrifugar el lisado durante 5 minutos a 1.000 g.
La concentración celular es adecuada si la absorbancia
del líquido sobrenadante, determinada a
541 nm, es de 0,62 ± 0,01. Corregir la concentración
celular por adición de un volumen de Solución
reguladora gelatina-barbital hasta un V f , calculado
por la fórmula siguiente:
AV o /0,62
en la cual V o es el volumen inicial de la suspensión
original y A es la absorbancia de la suspensión
original a 541 nm. La suspensión ajustada contiene
aproximadamente 10 9 células por ml.
Titulación de la hemolisina
Preparar las diluciones de hemolisina según el
siguiente esquema:
Preparada usando