VOLUMEN I

VACUNA CONTRA LA
DIFTERIA, ADSORBIDA
Vaccinum diphtheriae adsorbatum
Definición - La Vacuna contra la Difteria,
Adsorbida es una preparación de toxoide diftérico
formolizado, adsorbido sobre un soporte mineral. El
toxoide formolizado se debe preparar a partir de la
toxina producida por cultivo de Corynebacterium
diphtheriae y debe cumplir con los siguientes
requisitos.
PRODUCCIÓN
Consideraciones generales
El método de producción debe estar validado
para demostrar que el producto, al ser analizado,
cumple con el siguiente requisito.
Toxicidad específica
Seleccionar un grupo de cinco cobayos sanos,
de 250 a 350 g de peso, sin tratamiento previo con
alguna sustancia que pueda interferir con el ensayo.
Inyectar a cada animal por vía subcutánea cinco
veces la dosis humana indicada en el rótulo. Si
dentro de los 42 días siguientes a la inyección,
ninguno de los animales muere o muestra síntomas
de toxemia diftérica, la vacuna cumple con el
ensayo. Si muere más de un animal por causas
inespecíficas, repetir el ensayo una vez; si muere
más de un animal esta segunda vez, la vacuna no
cumple con el ensayo.
Toxoide diftérico purificado a granel
En la producción de la toxina diftérica a partir
de la cual se obtiene el toxoide, debe utilizarse un
sistema definido de cultivo con lotes semilla que
conserve la toxigenicidad del microorganismo; en
caso de ser necesaria, esta toxigenicidad, debe ser
restaurada por una reselección deliberada a partir de
los lotes semillas. Los cultivos deben realizarse en
un medio líquido apropiado y con una cepa
altamente toxigénica de Corynebacterium
diphteriae, de procedencia e historia documentadas.
Al final del periodo de incubación debe
comprobarse la pureza de cada cultivo y se deben
descartar los cultivos contaminados. El medio
conteniendo la toxina se debe cosechar
asépticamente y separar de la masa bacteriana tan
pronto como sea posible. Se debe determinar el
contenido en toxina (Lf por ml) para monitorear la
consistencia de la producción. Para la preparación
del granel del toxoide purificado se pueden mezclar
cosechas individuales de toxina tetánica. La toxina
debe purificarse con el objeto de eliminar sustancias
que pudieran causar efectos adversos en humanos.
La toxina purificada se debe detoxificar por
tratamiento con formaldehído por un método que
evite la destrucción de la potencia inmunogénica
del toxoide así como su reversión a toxina,
particularmente si se expone al calor. También es
posible llevar a cabo la purificación después de la
detoxificación.
Para la producción de la preparación final de
vacuna a granel sólo pueden utilizarse
preparaciones de toxoide purificado que cumplan
con los siguientes requisitos:
Ensayos de esterilidad
Debe cumplir con los requisitos, sembrando
10 ml en cada medio.
Ausencia de toxina e irreversibilidad del
toxoide
Preparar una solución del toxoide purificado a
granel de aproximadamente 100 Lf por ml., usando
la misma solución reguladora de la vacuna sin
adsorbente. Dividir la solución en dos porciones
iguales. Conservar una de ellas a 5 ± 3 °C y la otra
a 37 °C durante 6 semanas. Realizar el ensayo para
la determinación de toxina diftérica activa en
células Vero utilizando 50 µl por pocillo de ambas
porciones. La muestra no debe contener
conservantes antimicrobianos y los agentes
detoxificantes deben estar presentes en una
concentración menor a la concentración tóxica para
células Vero. La toxicidad no específica puede ser
eliminada por diálisis.
Utilizar células Vero recientemente tripsinizadas
a una concentración adecuada, por ejemplo
2,5 × 10 5 cels por ml y toxina diftérica de referencia
diluida en el toxoide diftérico 100 Lf por ml. Una
toxina diftérica de referencia adecuada debe
contener no menos de 100 LD 50 por ml o 67 a 133 lr
por 100 en 1 Lf y 25.000 a 50.000 dosis mínimas
reactivas para piel de cobayos en 1 Lf. Diluir la
toxina en toxoide diftérico 100 Lf por ml a una
concentración adecuada, por ejemplo 2 × 10 -4 Lf
por ml. Preparar diluciones seriadas al medio de la
toxina diftérica de referencia diluida y usar las
muestra a ensayar sin diluir (50 µl por pocillo).
Distribuirlas en los pocillos de una placa estéril para
cultivo celular conteniendo el medio adecuado para
células Vero. Para asegurar si cualquier efecto
citotóxico encontrado es específico de la toxina
diftérica, preparar diluciones en paralelo donde la
toxina es neutralizada con una concentración
adecuada de antitoxina diftérica, por ejemplo
100 UI por ml. Para verificar el crecimiento normal
de las células Vero, incluir en cada placa pocillos de
control que no contengan toxoide ni toxina y que
contengan un toxoide no tóxico a 100 Lf por ml.
Agregar la suspensión celular en cada pocillo, tapar
las placas e incubar a 37 ºC durante 5 a 6 días. El
efecto citotóxico es evidenciado cuando hay una
inhibición completa del metabolismo de las células