VOLUMEN I

Cuando se indica para un banco maestro de
células, un banco de trabajo de células, un lote de
semilla de virus o para controles de células,
proceder según se indica en Método de cultivo y
Método del indicador en cultivos celulares.
Cuando se indica para cosechas virales, graneles de
vacuna o lotes finales de producto proceder según
se indica en Método de cultivo.
Realizar el ensayo usando un número suficiente
de medios líquidos y sólidos que asegure el
crecimiento en las condiciones de incubación
elegidas de un pequeño número de micoplasmas
que puede estar presente en el material a ser
examinado. Los medios líquidos deben contener
rojo fenol. Las propiedades nutritivas de cada
nuevo lote de medio se deben verificar usando los
siguientes organismos:
Acholeplasma laidlawii: para vacunas a las que
se les ha agregado antibiótico durante su
producción.
Mycoplasma gallisepticum: cuando se ha usado
material de origen aviar durante la elaboración.
Mycoplasma orale: para vacunas de uso
humano.
Mycoplasma pneumoniae: para vacunas de uso
humano.
Mycoplasma synoviae: para vacunas de uso
humano.
Dividir los medios inoculados en dos porciones
iguales e incubar una en condiciones aeróbicas y la
otra en condiciones de microaerofilia; para medios
sólidos mantener una atmósfera de adecuada
humedad para prevenir la evaporación de la
superficie. Para medios sólidos en condiciones
aeróbicas, incubar en una atmósfera de aire que
contenga entre 5 y 10 %de dióxido de carbono. Para
medios sólidos en condiciones de microaerofilia
incubar en una atmósfera de nitrógeno que contenga
entre 5 y 10 % de dióxido de carbono.
Realizar la determinación de las propiedades
nutritivas para cada nuevo lote de medio. Inocular
el medio elegido con el organismo de ensayo
correspondiente; usar no más de 100 ufc por placa
de 60 mm conteniendo 9 ml de medio sólido y no
más de 40 ufc por envase de medio líquido
conteniendo 100 ml; usar placas separadas para
cada organismo ensayado. Incubar los medios en las
condiciones que serán usadas para el ensayo sobre
producto. El medio cumple con el ensayo para
propiedades nutritivas si se verifica un apropiado
crecimiento del organismo y un apropiado cambio
de color del medio líquido.
Realizar el ensayo de propiedades nutritivas en
presencia del producto en ensayo. Si el crecimiento
del organismo elegido es menor que el encontrado
en ausencia del producto, éste contiene sustancias
inhibitorias que deben ser neutralizadas antes de
realizar el ensayo para micoplasmas. La efectividad
de la neutralización u otro proceso debe ser
comprobada repitiendo el ensayo para sustancias
inhibitorias después de la neutralización.
Para medios sólidos usar placas de 60 mm de
diámetro conteniendo 9 ml de medio. Inocular
0,2 ml del producto a ser examinado en cada una de
por lo menos dos placas de medio sólido. Para
medios líquidos inocular 10 ml de producto cada
100 ml de medio. Incubar entre 35 y 38 ºC en
condiciones de aerobiosis y de microaerofilia,
durante 21 días; paralelamente incubar una porción
de 100 ml de cada medio sin inocular para usar
como control. Si durante el agregado del producto
en ensayo se produce cualquier cambio de pH,
restaurar el valor de pH del medio de cultivo
mediante el agregado de una solución de hidróxido
de sodio o de ácido clorhídrico.
Al primero, segundo y tercer día después de la
inoculación subcultivar cada cultivo líquido por
inoculación de 0,2 ml en cada una de dos placas de
cada medio sólido utilizado e incubar entre 35 y
38 ºC en aerobiosis y microaerofilia durante no
menos de 21 días. Repetir este procedimiento al
sexto, séptimo y octavo día y nuevamente a los
trece o catorce días de iniciado el ensayo. Observar
los medios líquidos cada dos o tres días y si se
produce cualquier cambio de color subcultivar
inmediatamente. Observar los medios sólidos una
vez a la semana.
Si los medios líquidos evidencian
contaminación fúngica o bacteriana repetir el
ensayo. Si, no antes de los 7 días después de la
inoculación, no más de una placa de cada paso del
ensayo se contamina con hongos o bacterias o se
rompe, esa placa debe ser ignorada si se comprueba
por examinación inmediata que no presenta
evidencia de crecimiento de micoplasmas. Si, en
cualquier paso del ensayo más de una placa se