VOLUMEN I

750. VALORACIÓN DE ESTEROIDES
Los siguientes procedimientos se aplican a la
determinación de esteroides codificados en la
Farmacopea que poseen grupos funcionales
reductores, como por ejemplo -cetoles. A menos
que se especifique de otro modo en la monografía
correspondiente, emplear el método de Valoración
directa.
VALORACIÓN DIRECTA
Solución estándar - Disolver en alcohol una
cantidad apropiada de la Sustancia de referencia
especificada en la monografía correspondiente,
previamente secada bajo las condiciones
especificadas y exactamente pesada. Diluir
cuantitativamente y en etapas con alcohol hasta
obtener una solución con una concentración
conocida de aproximadamente 10 µg por ml.
Transferir 20 ml de esta solución a un erlenmeyer
de 50 ml con tapón de vidrio.
Solución muestra - Proceder según se
especifique en la monografía correspondiente.
Procedimiento - Agregar a cada uno de los dos
erlenmeyer que contienen la Solución muestra y la
Solución estándar y a un erlenmeyer similar que
contiene 20,0 ml de alcohol que se empleará como
blanco, 2,0 ml de una solución preparada
disolviendo 50 mg de azul de tetrazolio en 10 ml de
metanol, y mezclar. Agregar 2,0 ml de una mezcla
de alcohol e hidróxido de tetrametilamonio (SR)
(9:1) a cada erlenmeyer, mezclar y dejar reposar en
la oscuridad durante exactamente 90 minutos.
Determinar las absorbancias de las soluciones
obtenidas partir de la Solución muestra y la
Solución estándar en celdas de 1 cm, a 525 nm, con
un espectrofotómetro apropiado, contra el blanco.
Calcular la cantidad de sustancia valorada
empleando la fórmula indicada en la monografía
correspondiente, en la cual C es la concentración;
en µg por ml, de la Solución estándar y A M y A E
son las absorbancias de las soluciones obtenidas a
partir de la Solución muestra y la Solución
estándar, respectivamente.
VALORACIÓN DE UN ESTEROIDE
AISLADO PREVIAMENTE
En el siguiente procedimiento, el esteroide a
valorar es separado de los esteroides relacionados y
excipientes por cromatografía en capa delgada y
valorado luego empleando el método descrito
anteriormente. Emplear este método cuando se
especifique en la monografía correspondiente.
Preparación de la placa - Preparar una mezcla
de 30 g de gel de sílice para cromatografía y una
sustancia fluorescente apropiada con 65 ml de una
mezcla de agua y alcohol (5:2). Extender la mezcla
a una placa, de 20 cm 20 cm hasta obtener una
capa uniforme de 0,25 mm de espesor y dejar secar
a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Activar la placa a 105 °C durante 1 hora y
almacenar en un desecador.
Fase móvil A - Cloruro de metileno y metanol
(45:4).
Fase móvil B - Cloroformo y acetona (4:1).
Solución estándar - Disolver una cantidad
apropiada de la Sustancia de referencia
especificada en la monografía correspondiente,
previamente secada y exactamente pesada, en una
mezcla de cloroformo y alcohol (50:50), hasta
obtener una solución con una concentración
conocida de aproximadamente 2 mg por ml.
Solución muestra - Proceder según se
especifique en la monografía correspondiente.
Procedimiento - Dividir la placa cromatográfica
en tres secciones iguales; las secciones laterales se
emplearán para aplicar la Solución muestra y la
Solución estándar, respectivamente. En la sección
central se aplicará el blanco. Aplicar 200 µ1 de la
Solución muestra y 200 µ1 de Solución estándar en
bandas, a una distancia de 2,5 cm del borde de la
placa, en la sección correspondiente. Secar con la
ayuda de una corriente de aire, sin calentar.
Empleando la Fase móvil especificada en la
monografía correspondiente, desarrollar la placa
hasta que el frente del solvente haya corrido
aproximadamente 15 cm por encima de la zona de
siembra. Retirar la placa de la cámara, marcar el
frente del solvente y dejar evaporar. Examinar la
placa bajo luz ultravioleta y marcar la banda
principal en la sección de la placa correspondiente a
la Solución estándar. Marcar también las bandas
correspondientes en las secciones de la Solución
muestra y del blanco de la placa. Retirar el gel de
sílice de cada banda por separado y transferirlo a
sendos tubos de centrífuga de 50 ml con tapa de
vidrio. A cada tubo agregar 25,0 ml de alcohol y
agitar durante 2 minutos. Centrifugar durante
5 minutos, transferir 20 ml de la solución
sobrenadante de cada tubo a un erlenmeyer de
50 ml con tapa de vidrio, agregar 2,0 ml de una
solución preparada disolviendo 50 mg de azul de
tetrazolio en 10 ml de metanol y mezclar. Proceder
según se indica en el Procedimiento en Valoración
directa, comenzando donde dice: "Agregar 2,0 ml
de una mezcla... ".