VOLUMEN I

Estimar la potencia del Concentrado de Antitrombina
III Humana por comparación de su habilidad
para inactivar trombina en presencia de un
exceso de heparina con la misma habilidad de una
sustancia de referencia de antitrombina III humana
calibrada en UI. Mezclar cantidades variables de
antitrombina III con una cantidad dada de trombina
y determinar el remanente de trombina mediante
un sustrato cromogénico apropiado.
La Unidad Internacional es la actividad de antitrombina
III de una cantidad establecida de Patrón
Internacional de antitrombina III. La equivalencia
en Unidades Internacionales del Patrón Internacional
la establece la Organización Mundial de la Salud.
Aplicar la siguiente técnica.
Soluciones reguladoras - Emplear Tris-EDTA
pH 8,4 y Tris-EDTA BSA pH 8,4 (ver Soluciones
reguladoras en Reactivos y Soluciones).
Solución reguladora para dilución - Preparar
una solución de Tris-EDTA BSA pH 8,4 que contenga
15 UI de heparina por ml.
Solución de trombina bovina - Preparar una solución
que contenga 2 UI de trombina bovina por
ml de solución reguladora Tris-EDTA BSA pH 8,4.
Sustrato cromogénico - D-fenilalanil-
L-pipecolil-L-arginina-4-nitroanilida reconstituido
en agua para obtener una solución 4 mmol por litro.
Preparación estándar - Diluir la sustancia de
referencia de antitrombina III humana calibrada en
UI con Solución reguladora para dilución para
obtener una solución que contenga una 1 UI de
antitrombina III por ml. Realizar por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres diluciones
en el rango de 1/75 a 1/200 en progresión geométrica
o aritmética utilizando la misma Solución
reguladora.
Preparación muestra - Diluir El Concentrado
de Antitrombina III Humana con Solución reguladora
para obtener una solución que contenga 1 UI
de antitrombina III por ml. Realizar por duplicado y
en forma independiente por lo menos tres diluciones
en el rango de 1/75 a 1/200 en progresión geométrica
o aritmética utilizando la misma Solución
reguladora.
Procedimiento - Según el ensayo se realice en
tubos o en microplacas, ajustar los volúmenes de
manera que se mantengan las proporciones de la
mezcla. Realizar dos reacciones de cada dilución.
Precalentar 200 µl de cada dilución de la Preparación
muestra y de la Preparación estándar a 37 °C
durante 1 a 2 minutos. Agregar a cada dilución
200 µl de Solución de trombina bovina, mezclar y
mantener a 37 °C durante 1 minuto. Agregar 500 µl
de Sustrato cromogénico diluido hasta una concentración
apropiada para el ensayo usando solución
reguladora Tris-EDTA BSA pH 8,4 (sin albúmina).
Medir inmediatamente el cambio de las absorbancias
a 405 nm durante al menos 30 segundos. Calcular
el valor de A/min. Alternativamente puede
llevarse a cabo un ensayo de punto final deteniendo
la reacción con ácido acético y midiendo la absorbancia
a 405 nm o también es posible detener la
reacción de hidrólisis tras un intervalo apropiado
bajando el pH mediante el agregado de un reactivo
apropiado, como ácido acético al 50 %v/v o una
solución de citrato 1 M a pH 3. El valor de cambio
de absorbancia (A/min) o A es inversamente proporcional
a la actividad de antitrombina III. Calcular
la potencia de la muestra a examinar y comprobar
la validez del ensayo empleando los métodos
estadísticos habituales (ver 10. Análisis estadístico
de resultados de ensayos biológicos).
El método para determinar la actividad de heparina
en factores de coagulación es un ensayo cromogénico
en el cual se estima su actividad por su
efecto inhibitorio sobre el factor Xa (actividad anti-
Xa). La potencia de heparina se estima comparando
su actividad inhibitoria con un Patrón Internacional
o Patrón Nacional calibrado en Unidades
Internacionales.
La Unidad Internacional es la actividad de heparina
en una cantidad establecida de patrón Internacional.
La equivalencia en Unidades Internacionales
del Patrón Internacional la establece la Organización
Mundial de la Salud.
El método cromogénico de valoración consiste
en los siguientes pasos: la formación del complejo
heparina-antitrombina III, en el cual se debe asegurar
un exceso de antitrombina III en el medio en el
que se produce la reacción, la formación del complejo
heparina antitrombina III-factor Xa, en el cual
el factor Xa debe estar en exceso, y el clivaje enzimático
de un sustrato cromogénico específico
para factor Xa (residual) para dar un cromóforo que
puede ser cuantificado espectrofotométricamente.
Bajo condiciones adecuadas, existe una relación