VOLUMEN I

modo continuo,por medio de la lectura de la velocidad
de cambio de absorbancia a 405 nm continuamente
por un período de tiempo y obtener la
velocidad media del cambio de absorbancia
(A/min)o también es posible detener la reacción
de hidrólisis tras un intervalo apropiado bajando el
pH por adición de un reactivo apropiado, como
ácido acético al 50 % v/v o una solución de citrato
(1 mol por litro), a pH 3. Ajustar el tiempo de
hidrólisis para conseguir un incremento lineal del
cromóforo a lo largo del tiempo. Los tiempos adecuados
de hidrólisis suelen estar entre 3 y 15 min,
pero se admiten variaciones si con ellas se obtiene
una mejor linealidad en la reacción dosis-respuesta.
Comprobar la validez del ensayo y calcular la
potencia de la preparación a examinar empleando
los métodos estadísticos usuales (ver 10. Análisis
estadístico de resultados de ensayos biológicos).
El método para determinar la actividad de factor
IX es un ensayo de coagulación basado en la
capacidad del factor IX de reducir el tiempo de
coagulación de un plasma carente de factor IX. La
reacción es acelerada por el agregado de un reactivo
que contenga fosfolípidos y un activador de contacto
como por ejemplo caolín, sílica o ácido ellágico.
La potencia es determinada por comparación de la
curva dosis-respuesta de la preparación muestra,
con la de una preparación de referencia calibrada en
Unidades Internacionales.
La Unidad Internacional es la actividad de una
cantidad establecida de Patrón Internacional, que
consiste en un concentrado liofilizado de factor IX
de coagulación. La equivalencia en Unidades Internacionales
del Patrón Internacional la establece
la Organización Mundial de la Salud.
Plasma carente de factor IX
Reactivo que contenga fosfolípidos (Cefalina) y
un Activador de contacto (Caolín liviano (Sílica o
Ácido ellágico)).
Cloruro de calcio
Solución Reguladora Imidazol pH 7,3
Albúmina bovina o humana
Preparación estándar - Reconstituir la preparación
según las indicaciones de la preparación estándar.
Cuando corresponda, determinar la actividad
de heparina presente y neutralizarla mediante la
adición de por ejemplo sulfato de protamina (10 µg
de sulfato de protamina neutralizan 1 UI de heparina).
Diluir la preparación estándar con plasma
carente de factor IX para obtener una solución que
contenga entre 0,5 y 2,0 UI por mililitro. A partir
de esta dilución preparar, preferentemente por duplicado
y en forma independiente, al menos tres
diluciones, en progresión geométrica utilizando
solución reguladora adecuada (por ejemplo solución
reguladora de imidazol a pH 7,3 conteniendo 10 g
por litro de albúmina bovina o humana). Preparar
estas diluciones con precisión y utilizarlas inmediatamente.
Preparación muestra - Reconstituir la preparación
en ensayo según se indica en el rótulo y utilizar
inmediatamente. Cuando corresponda, determinar
la actividad de heparina presente y neutralizarla
mediante la adición de por ejemplo sulfato de protamina
(10 µg de sulfato de protamina neutralizan
1 UI de heparina). Diluir la preparación en ensayo
con plasma carente de factor IX para obtener una
solución que contenga entre 0,5 y 2,0 UI por mililitro.
Preparar diluciones en progresión geométrica
de igual manera que la preparación estándar.
Procedimiento - Usar un aparato apropiado para
medir tiempos de coagulación o realizar el ensayo
colocando los tubos en baño de agua a 37 °C. Realizar
la reacción por duplicado en el siguiente orden
E1, E2, E3, M1, M2, M3 y con el otro juego de
diluciones continuar en el siguiente orden M1, M2,
M3, E1, E2 y E3. Colocar en cada tubo 0,1 ml
plasma carente de factor IX y 0,1 ml de una de las
diluciones de la Preparación estándaro de la Preparación
muestra. Añadir a cada tubo 0,1 ml de un
reactivo que contenga fosfolípidos y un activador
de contacto apropiado para Tiempo de Tromboplastina
Parcial Activado (TTPA) e incubar el tiempo
recomendado a 37 °C. A cada tubo añadir 0,1 ml
de una solución 3,7 g por litro de cloruro de calcio
previamente calentado a 37 °C. Utilizando un
cronómetro, medir el tiempo de coagulación, es
decir, el intervalo entre el momento de agregado del
cloruro de calcio y la primera indicación de formación
de fibrina. [NOTA: se recomienda utilizar
material plástico; los volúmenes se pueden modificar
al igual que los tiempos de incubación; se pueden
emplear reactivos comerciales siempre que se
compruebe que los resultados son iguales.] Calcular
la potencia empleando los métodos estadísticos
habituales (ver 10. Análisis estadístico de resultados
de ensayos biológicos).
El método para determinar la actividad de factor
X de coagulación es un ensayo cromogénico en
el cual se determina su actividad por su activación
específica para formar factor Xa. La potencia de la
preparación de factor X se estima comparando su
actividad con un Patrón Internacional o una sustan-