VOLUMEN I

mitad debe ser analizada, si fuera necesario, en
cultivos de células renales de otra especie de mono,
de tal modo que las pruebas sean practicadas en
cultivos celulares procedentes de al menos una
especie de sensibilidad conocida frente al virus
SV40.
Inocular las suspensiones neutralizadas en
frascos de estos cultivos celulares, de modo que la
dilución de la suspensión en el medio nutritivo no
exceda una proporción 1 en 4. El área de la capa
celular debe ser al menos 3 cm 2 / ml de suspensión
neutralizada. Al menos un frasco de cada tipo de
cultivo celular no se debe inocular para emplear
como control. Mantener este frasco con medio
nutritivo que contenga la misma concentración de
antisuero específico utilizado para la neutralización.
Se puede emplear suero animal en la multiplicación
de las células, con la condición de que no contenga
anticuerpos SV40, pero después de la inoculación
de la preparación en el material de ensayo, el medio
de mantenimiento no debe contener otro suero que
el antisuero neutralizante del poliovirus, salvo en
las condiciones descriptas más adelante.
Los cultivos se deben incubar a una temperatura
entre 35 y 37 °C y observar durante un período de
al menos 4 semanas. Durante este período de
observación, y después de 2 semanas de incubación
como mínimo, se efectúa al menos 1 subcultivo de
cada uno de los cultivos sobre el mismo sistema de
cultivo celular. Los subcultivos también se deben
mantener en observación durante al menos 2
semanas. Se puede agregar suero al cultivo inicial
en el momento del subcultivo, con la condición de
que no contenga anticuerpos SV40.
Realizar ensayos adicionales para determinar la
ausencia de agentes extraños en otra muestra de
cosechas individuales neutralizadas, por
inoculación de 10 ml de muestra en cultivos de
células humanas sensibles al virus del sarampión.
Las técnicas de inmunofluorescencia resultan
útiles para la detección del virus SV40 o de otros
virus en las células.
Los ensayos no son válidos si más de 20 por
ciento de los frascos del cultivo fueron rechazados
por razones accidentales no específicas al final de
los períodos de tiempo respectivos de los ensayos.
Si se produce algún cambio citopático en alguno
de los cultivos, se deben investigar las causas del
mismo. Si se demuestra que los cambios citopáticos
se deben a poliovirus no neutralizados, se debe
repetir el ensayo. Si se evidencia la presencia de
SV40 o de otros agentes extraños atribuibles a la
cosecha individual, ésta debe ser descartada.
Cosechas monovalentes (mezcla)
Las cosechas monovalentes (mezcla) se deben
preparar mezclando un número de cosechas
individuales satisfactorias del mismo tipo viral. Las
cosechas monovalentes (mezcla) producidas en una
línea celular continua pueden ser purificadas.
Filtrar cada cosecha monovalente (mezcla) a través
de un filtro que retenga las bacterias.
Para la preparación de la vacuna final a granel
sólo se puede utilizar una cosecha monovalente
(mezcla) que cumpla con los siguientes requisitos.
Identificación
Identificar poliovirus de un tipo dado en cada
cosecha monovalente (mezcla) empleando
anticuerpos específicos.
Concentración de virus
Determinar la concentración del virus según se
indica en Valoración como base para el cálculo de
las diluciones para la preparación de la vacuna final
a granel, para tener la cantidad de virus empleado
en 339. Ensayo de neurovirulencia para vacunas a
virus vivo y para establecer y monitorear la
uniformidad de la producción.
Marcadores genéticos
Determinar la relación entre la capacidad de
multiplicación del virus en la mezcla monovalente
cosechado en un rango de temperaturas
comprendidas entre 36 y 40 °C en comparación con
el lote semilla o con una preparación de referencia
destinada a ensayos de marcador y con cepas rct/40-
y rct/40+ adecuadas del poliovirus del mismo tipo.
Controlar las temperaturas de incubación empleadas
en el ensayo, con una precisión de ± 0,1 °C. La
cosecha monovalente (mezcla) cumple con el
ensayo si el título del virus determinado a 36 °C,
cuando tanto en la cosecha como en la preparación
de referencia, el título es al menos 5,0 log mayor
que el determinado a 40 °C. Si el crecimiento a
40 °C es tan bajo que no se puede establecer una
comparación válida, se emplea una temperatura
comprendida entre 39,0 y 39,5 °C; a esta
temperatura la reducción del título de virus en el
material de referencia debe ser tal que se encuentre
entre 3,0 log y 5,0 log de su valor a 36 °C; la
reducción mínima aceptable, para cada cepa de
virus, se debe determinar a una temperatura dada.
Si los títulos obtenidos para 1 o más de los virus de
referencia no son concordantes con los valores
esperados se debe repetir el ensayo.
Ensayo de Neurovirulencia para vacunas a
virus vivo
Proceder según se indica en Ensayo para la
vacuna contra la poliomielitis oral.